幾種方法聯合檢測對肺結核病的診斷價值

劉長茹

結核病是一種較嚴重的傳染病，目前的疫情呈上升趨勢。檢出痰中含有結核桿菌是臨床診斷肺結核或鑒別肺結核與其他肺病的重要依據。痰中結核桿菌的檢測方法常規采用痰涂片及痰培養。涂片雖簡單易行，但陽性率低，培養雖為金標準，但周期太長，均難以滿足臨床需要。近年來，一些針對結核分支桿菌檢測的新方法陸續報道。本文對聚合酶鏈反應(PCR)法、噬菌體裂解法、PCR-斑點雜交法，幾種結核分支桿菌檢測方法的應用進行評價。

1 材料和方法

1.1 檢測對象 肺結核組121例肺結核病住院患者(經臨床確診)，其中痰菌涂片陽性者49例，涂陰者72例。非結核肺疾病組54例，他們中間慢阻肺者9例，上呼吸道感染者21例，肺炎20例，其他疾病4例。

1.2 檢測方法

1.2.1 PCR法 華美公司生產結核桿菌PCR檢測試劑盒(電泳法)，按說明進行操作。

1.2.2 噬菌體裂解法

1.2.2.1 試劑 英國BIOTEC公司結核桿菌檢測試劑盒(FAST Plaque TBTM)。

1.2.2.2 方法 按操作規程進行實驗及結果判定。

1.2.3 PCR-斑點雜交法 PCR法制備地高辛標記的探針INS-1(5'CGTGAGGGCATCGAGGTGGC)和INS-2(5'GCGTAGGCGTCGGTGACAAA)為引物，以BCG的DNA為模板，以dUTP-Dig:dTTP=3:1代替反應體系中的 dTTP的量。(dUTP-Dig:Roche公司)，經 PCR擴增，得到地高辛標記的245bp 探針［1］。

標本前處理，標本加入1～2倍體積NoAc溶液，液化20 min，90℃水浴30 min，離心去上清，向沉淀中加入溶菌酶(promega公司)30 min，加入 SDS/蛋白酶 K 20 min。

取3 ul點膜，晾干;堿變性5 min，80℃烘干10 min;加入變性的探針進行雜交，42℃ 3 h。雜交后洗膜加入anti-Dig-Ap(Roche公司)與探針上標記的地高辛反應。采用發光自顯影技術(CDP-star:Roche公司)檢測雜交帶。

痰標本經PCR擴增后，用斑點雜交方法進行標記探針的雜交檢測。

2 結果

2.1 幾種檢測方法的敏感性實驗 結核桿菌菌液分別配制不同濃度(Mcfarland 3.0濁度相當于細菌濃度107cFu/ml)進行四種方法檢測結核桿菌。PCR法、斑點雜交法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢出最低濃度分別為50、5×102、20、5×102cFu/m l。

2.2 PCR法對涂陽、涂陰、非結核病標本的檢出率分別為89.8%、29.2%、1.9%;PCR-斑點雜交法的檢出率分別為98.0%、43.1%、1.9%;噬菌體裂解法的檢出率分別為93.9%、23.6%、0;PCR法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢測結核桿菌其靈敏度分別為53.7%、38.8%、65.3%、52.1%，特異度分別為98.1%、100%、98.1%、100%。見表1

表1 四種方法檢測結核桿菌的結果

3 討論

對于肺結核的實驗室診斷，涂片找抗酸桿菌還是最普及和經濟的方法，但其陽性率很低(30%左右)。結核桿菌培養仍是目前診斷MTB的金標準，尤其是藥敏實驗結果在指導臨床用藥及耐藥性監測等方面具有重要作用，但其耗時太長則有待改進。

PCR法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢測結核桿菌其敏感性分別為40、20、3×102cFu/ml，檢測濃度均低于痰涂片的檢測濃度(5×103cFu/ml)。

PCR法檢測結核桿菌其靈敏度為53.7%、特異度為98.1%。該方法具有敏感性高、診斷速度較快等優點，但還存在一定程度的不穩定性［2］。本文中出現一例假陽性，可能是標本內抑致物引起或標本、試劑污染所致。PCR-斑點雜交法檢測結核桿菌其靈敏度為65.3%、特異度98.1%，其靈敏度和敏感性均有待提高［3］。而特異性強的DNA探針雜交與敏感性高的PCR技術相結合已成為結核病實驗研究、診斷應用的一種良好途經。

應用噬菌體進行結核菌的研究亦開始起步，通過實驗得出噬菌體裂解法檢測結核桿菌其靈敏度為52.1%、特異度為100%。該方法為結核菌的檢測和生、死菌的鑒別、特別是在結核菌藥物敏感性實驗上的應用開辟了一個新途徑［4］。

本文中介紹的幾種方法都具有較高的敏感性，對于結核病的診斷有較高靈敏度和特異度;隨著這幾種檢測方法的不斷成熟和完善、實驗試劑的商業化、實驗步驟的標準化，這幾種方法有望成為結核病實驗室診斷及鑒別診斷的有效方法之一。

［1］ 李書琳，韓中波，徐新順，等．吉林市結核分支桿菌IS6110 DNA指紋圖譜特征分析．中國防癆雜志，2002，24(6):313-316．

［2］ ShanKar P，Manjunath N，MohanK K，et al．Papid diagnosis of tuberculosis Meninigitis by polymerase chain reaction．The lancet，1991，237(4):5-7．

［3］ 張靈霞，莊玉輝，楊華衛，等．rDNA探針雜交檢測病人痰標本中結核桿菌研究．中國防癆雜志，2000，22(3):127-129．

［4］ 劉志輝，羅一魯．結核病實驗診斷現狀及展望．中國防癆雜志，2003，25(1):38-40．