軟骨形態發生蛋白1誘導犬真皮成纖維細胞向軟骨細胞表型分化的實驗研究

趙貴慶 崔磊 曹誼林

軟骨形態發生蛋白1誘導犬真皮成纖維細胞向軟骨細胞表型分化的實驗研究

趙貴慶 崔磊 曹誼林

目的探討軟骨形態發生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP1）誘導體外培養的犬真皮成纖維細胞（Dermal fibroblasts，DFs）向軟骨細胞表型分化的可行性。方法應用CDMP1細胞誘導液對體外擴增至第4代的犬DFs進行誘導培養，觀察細胞的形態變化，以免疫熒光染色和RT-PCR檢測細胞中軟骨特異蛋白的表達情況。結果誘導培養6 d后，實驗組部分DFs呈星形或多角形，免疫組化染色顯示有軟骨特異的II型膠原分泌，RT-PCR檢測也表明有Ⅱ型膠原、aggrecan和SOX9表達。但是誘導培養10 d后，均轉為陰性。結論CDMP1可以誘導犬DFs向軟骨細胞表型分化，有可能成為組織工程化纖維軟骨的種子細胞。

真皮成纖維細胞纖維軟骨細胞軟骨形態發生蛋白-1組織工程

纖維軟骨主要分布于半月板、顳下頜關節盤、椎間盤等關節內，細胞外基質中含有大量的Ⅰ型膠原和少量的Ⅱ型膠原以及粘多糖。由于纖維軟骨中沒有血運，再生能力差，所以纖維軟骨的損傷往往引起重要的功能障礙，如顳下頜關節盤損傷引起的顳下頜關節功能紊亂等，嚴重影響了患者的生活質量。組織工程的發展為纖維軟骨的修復提供了新的途徑。

真皮成纖維細胞（Dermal fibroblasts，DFs）是真皮組織中合成細胞外基質的主要細胞，也是人體中分布最為廣泛、數量最多、最易于獲取和體外培養的細胞。我們的早期研究發現，軟骨形態發生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP1）可以誘導人DFs向軟骨細胞表型分化[1－3]。本研究將深入探索DFs作為纖維軟骨種子細胞的可能性。

1 對象與方法

1.1 細胞來源

犬皮膚成纖維細胞來自成年健康Beagle犬（購自上海農學院）腹部皮膚真皮組織。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑及來源

CDMP1（PeproTech公司，美國），DMEM培養基、F12培養基（Gibco，美國），胎牛血清（FBS）（Hyclone，美國），綿羊血清（BSA）（上海華美生物工程公司），RT－PCR引物（上海生工生物工程技術服務有限公司），vimentin多克隆抗體（Santa Cruz公司），Fibronectin單克隆抗體（Aachen公司，德國），鼠抗人CollagenⅠ（Cambridge公司，英國），鼠抗人CollagenⅡAb3（Neomarkers公司，美國），AMV逆轉錄酶XL（大連寶生物工程有限公司）。

1.2.2 主要儀器及型號

CO2培養箱（Forma公司，美國），無菌超凈工作臺（上海博訊實驗有限公司），恒溫搖床（太倉華美生化儀器廠），普通臺式離心機（TDL-40B，上海安亭醫療儀器廠），光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），精密電子天平（Sartorius公司，德國），60 mm、100 mm培養皿和50 mL離心管（Falcon公司，美國），0.22 μm針孔過濾器（Millipore公司，美國）。

1.3CDMP1誘導培養DFs及DFs分化檢測

1.3.1 細胞獲取

無菌條件下切取犬下腹部皮膚2 cm×2 cm，分離、提純DFs，體外擴增培養至第4代，備用。

1.3.2 細胞鑒定

應用兔抗人vimentin多抗克隆抗體和鼠抗人Fibronectin單克隆抗體對體外擴增培養第4代的犬DFs進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察確定分離細胞的類型。

1.3.3 誘導培養

取第4代近融合的DFs，按4×105個/皿的細胞密度接種于100 mm培養皿，實驗組加入7 mL含100 ng/mL的CDMP1、含10%FBS的DMEM/F12培養液（軟骨誘導液），對照組中加入等量含10%FBS的DMEM/F12培養液（基礎培養液），37℃、5%CO2環境中培養，每3天換液1次，觀察細胞形態的變化。

1.3.4 免疫熒光染色

分別消化收集單層CDMP1誘導和非誘導培養6 d的DFs，制備細胞爬片，進行Ⅰ型和Ⅱ型膠原的免疫熒光染色。以原代培養的透明軟骨細胞作為Ⅱ型膠原的陽性對照和Ⅰ型膠原的陰性對照，以原代培養的半月板纖維軟骨細胞為Ⅰ型膠原的陽性對照。檢測細胞分泌軟骨主要細胞外基質的能力。

1.3.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

以從新鮮犬半月板中提取的RNA為陽性對照，成軟骨誘導6 d的DFs為實驗組，未誘導的DFs為對照組，檢測Ⅰ型膠原Ⅰα1，Ⅱ型膠原Ⅱα1以及aggrecan和SOX9基因的表達，以GAPDH為內參照，引物序列如表1所示。

表1 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）中應用的引物Table 1Nucleotide primers used for RT－PCR

2 結果

2.1Vimentin和Fibronectin免疫熒光染色

擴增至第4代的真皮成纖維細胞形態均一，表現出典型的長梭形，細胞突起較長，互相連接，細胞在培養皿中黏附良好，具有較強的活力。第4代真皮成纖維細胞Vimentin和Fibronectin免疫熒光染色陽性，在胞質中具有較強表達（圖1），證明自犬皮膚中獲取的成纖維細胞具有間充質來源特性。

2.2CDMP-1誘導單層培養的DFs向軟骨細胞分化

第4代的DFs接種后以含有100 ng/mL的CDMP1誘導培養，以不含有CDMP1的為對照組。1 d后實驗組（圖2A）和對照組（圖2D）無明顯差異，細胞均為長梭形；6 d后，實驗組（圖2B）和對照組（圖2E）有明顯的不同，對照組仍是成纖維細胞典型的長梭形，而實驗組中有一部分細胞呈橢圓形或星形，其余細胞呈長梭形；在培養10 d后，實驗組和對照組細胞均呈長梭形，指紋狀排列，兩組間沒有差異。

2.3 細胞免疫熒光染色

Ⅱ型膠原是軟骨細胞特異的細胞外基質，真皮組織中不含有Ⅱ型膠原。CDMP1誘導6 d后，Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示，部分細胞呈陽性；非誘導組細胞未見有陽性結果。Ⅰ型膠原在誘導組和非誘導組中均呈強陽性表達，即DFs在表達Ⅱ型膠原的同時，保留了Ⅰ型膠原的表達（圖3）。

2.4RT-PCR

CDMP1誘導的DFs單層培養6 d后，RT-PCR檢測表明，誘導組和陽性對照組中Col 2和SOX9表達陽性，而對照組中未見有表達；aggrecan在實驗組和對照組中均有表達，但是實驗組和陽性對照組的條帶亮度明顯較對照組強；而ColⅠα1在各組中均為高表達，無明顯差異（圖4）。

圖1 第4代犬DFs（400×）Fig.1The 4thpassage of DFs(400×)

圖2 CDMP1誘導單層培養的DFs（400×）Fig.2The morphology of canine DFs treated with CDMP1(400×)

圖3 6d后，Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原免疫熒光染色檢測（熒光顯微鏡，400×）Fig.3After 6 days,confirmed by ColⅠandⅡimmunofluorescent staining(Fluorescence microscope,400×)

圖4 RT－PCR檢測Fig.4RT-PCR detection

3 討論

CDMPs是BMP家族的成員，CDMP1又稱為BMP14、GDF5，是與軟骨形態發生和發育相關的最為特異的一類生長因子，CDMP1在出生后可繼續維持其生物學特性，并促進軟骨組織的損傷修復過程[4]。CDMP1主要通過調節間充質前體細胞的分化，參與軟骨組織發生、發育與損傷修復的全部的生物學過程，是調節軟骨細胞分化的重要生長因子[5]。研究發現，CDMP1可以誘導三維培養的骨髓來源間充質細胞向軟骨細胞表型分化[6]；CMDP1可以在體外誘導韌帶來源的成纖維細胞向軟骨細胞的表型分化，并且沒有堿性磷酸酶活性的上調[7]。我們的早期研究發現，CDMP1可以誘導體外單層培養的人真皮成纖維細胞表達軟骨特異的Ⅱ型膠原和aggrecan[5]。

真皮成纖維細胞是分化完全的終末體細胞，通常認為其不再具備如干細胞那樣向其他類型細胞分化的能力。但是，近年來的研究發現，真皮中含有一些具有干細胞特性的亞細胞類型，在一定的條件下可以向軟骨細胞、骨細胞和脂肪細胞表分化[8]。我們的早期研究證明，DFs可以在體外構建組織工程肌腱和角膜[9]。DFs獲取簡單，可在短時間內擴增至所需的細胞數量，傳代過程中不會去分化。所以，真皮中的成纖維細胞可能是一個潛在的組織工程化種子細胞庫。已有文獻報道多種方法可以誘導DFs向軟骨細胞系分化，如SOX5、6和9因子聯合轉染[10]、在aggrecan或perlecan涂層的二維表面上培養[11]以及與脫鈣骨粉的共培養[12]等。

本研究以成年Beagle犬為研究對象，分離培養皮膚中的成纖維細胞，在單層培養條件下，細胞具有成纖維細胞典型的長梭形特征。體外傳代至第4代后，細胞形態均一，具有較強的增殖能力；免疫熒光檢測發現，細胞中Vimentin和Fibronectin呈陽性表達，這說明我們分離培養的細胞具有間充質來源細胞的特性。

我們應用含有100 ng/mL CDMP1的誘導液培養單層條件下的DFs，發現6 d后誘導組細胞形態與非誘導組有明顯的區別，非誘導組中細胞呈典型的成纖維細胞狀外觀，而誘導組中一部分細胞呈橢圓形或多角形，類似于原代培養的透明軟骨細胞。在第10天時，由于細胞增殖，培養皿中細胞密度增大，誘導組和非誘導組細胞均表現為成纖維細胞樣長梭形特征，兩組之間沒有差別。對體外誘導培養第6天的細胞進行細胞爬片，免疫熒光染色發現，誘導組中部分細胞Ⅱ型膠原染色陽性，而對照組中未見有陽性細胞。Ⅰ型膠原染色發現，不論誘導組還是非誘導組都表現為強陽性。誘導培養第10天時，兩組中Ⅱ型膠原染色均為陰性，Ⅰ型膠原染色均為陽性。對體外誘導第6天和第10天的細胞進行RT-PCR檢測，也進一步證實了上述結果。值得注意的是，RTPCR顯示，在培養第6天時，誘導組中SOX9和aggrecan表達陽性，而在非誘導組中僅有aggrecan的微量表達。SOX9是軟骨細胞的一個重要的轉錄因子，它是屬于HMG box（High mobility group）家族中的SRY（Sex determining region Y）亞家族。有研究發現，在胚胎發育過程中，SOX9與Ⅱ型膠原的表達具有平行關系[2]。這說明，CDMP1可以在單層培養條件下誘導犬DFs表達軟骨特異的Ⅱ型膠原和aggrecan，使DFs向軟骨細胞表型分化，但是誘導10 d后，細胞的外形又恢復為長梭形結構，Ⅰ型膠原免疫熒光染色陰性，且Ⅱ型膠原及SOX9的表達均轉陰。可見，CDMP1不能在單層培養條件下維持DFs分化的軟骨細胞表型。我們早期的研究發現，CDMP1誘導微團培養的人DFs在2周后有大量細胞表現出軟骨陷窩結構，細胞外基質中有大量的黏多糖沉積[5]，提示三維環境可能更有利于細胞表型的維持。

總之，本研究表明，犬皮膚成纖維細胞在體外單層培養條件下具有較強的增殖能力，能夠滿足組織工程對種子細胞增殖能力的要求；CDMP1可以誘導單層培養的犬DFs向軟骨細胞分化，但是不能長期維持這種分化狀態。在后續的研究中，我們將對CDMP1誘導三維培養的DFs向軟骨細胞分化的能力進行更為深入地研究。

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（收稿日期：2011年4月3日，修回日期：2011年4月27日）

Study of CDMP1 Inducing DFs into Chondrogenic Lineage in Vitro

ObjectiveTo explore the feasibility of cartilage-derived morphogenetic protein-1(CDMP1)inducing dermal fibroblasts(DFs)into chondrogenic lineage.MethodsThe fourth passage of DFs isolated from canine were induced by CDMP1.The morphological changes were observed and the expression of cartilage specific proteins were detected by immunofluorescent staining and RT-PCR.ResultsAfter inducing 6 days,stellar-like or polygonal-like cells were observed, and cartilage specific collagen typeⅡwas detected by immunofluorescent staining as well as RT-PCR examination.Other cartilage specific proteins as aggrecan and SOX9 were detected by RT-PCR.But these effects could not be maintained after inducing 6 days.ConclusionCDMP1 could induce DFs into chondrogenic lineage,and CDMP1 induced DFs is promising to be the seed cell of engineered fibrochondrocytes.

Dermal fibroblasts;Fibrochondrocytes;Cartilage-derived morphogenetic protein-1;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0139－05

ZHAO Guiqing1,CUI Lei2,CAO Yilin2.
1 Yahan Medical Aesthetic Hospital,Changsha 410007,China.2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai 200011,China.

2011年3月12日，

2011年5月4日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.005

410000湖南省長沙市長沙亞韓醫學美容醫院（趙貴慶）；200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室（崔磊，曹誼林）。