人腹膜中間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步研究

吳黎敏 林慶凡 李航 李黎洪 張勁帆

人腹膜中間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步研究

吳黎敏 林慶凡 李航 李黎洪 張勁帆

目的探討人腹膜中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC），并研究其生物學(xué)特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的胃癌患者。將腹膜剪碎，Ⅰ型膠原酶消化后以低密度接種，2周后計(jì)算細(xì)胞群中成纖維細(xì)胞集落形成單位（Colony-forming unit-fibroblast，CUF-F）數(shù)量；流式細(xì)胞分析貼壁細(xì)胞表型；定向誘導(dǎo)2周后，堿性磷酸酶和油紅O染色，觀察細(xì)胞體外成骨和成脂肪能力。結(jié)果貼壁的細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，消化的腹膜細(xì)胞群中，CFU-F比例平均為0.574‰（0.26‰～0.84‰）。流式分析顯示，細(xì)胞均一表達(dá)CD29、CD44和CD73，不表達(dá)CD31、CD34和CD45。成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈現(xiàn)堿性磷酸酶活性；成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，油紅O染色陽(yáng)性。結(jié)論人腹膜中富含MSC，可作為一個(gè)含有生物支架的干細(xì)胞來(lái)源。

間充質(zhì)干細(xì)胞腹膜成纖維細(xì)胞集落形成單位

腹膜是一種源自中胚層的組織，富含血管，且有一定韌性。常規(guī)的體外培養(yǎng)方法構(gòu)建的組織工程化組織，缺乏血管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞缺乏氧供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是影響構(gòu)建組織體內(nèi)功能的關(guān)鍵因素。因此，腹膜因富含血管，已成為常用的生物材料，用于氣管、膀胱和腸組織的構(gòu)建[1-3]。此外，腹膜也可能是干細(xì)胞的來(lái)源。腹膜中的脂肪組織應(yīng)含有間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）[4]，而血管外膜是MSC體內(nèi)的存在部位。因此，我們推測(cè)，腹膜可能富含MSC，可作為含有自體干細(xì)胞的天然支架材料。為此，我們將手術(shù)切除的腹膜消化后進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)貼壁細(xì)胞的特性進(jìn)行了初步研究，證實(shí)了腹膜可作為MSC的來(lái)源之一。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司）。胎牛血清（北京元亨匯眾生物技術(shù)公司）。人MSC專用血清（Stem Cell公司）。單克隆抗體（BD公司）。分化誘導(dǎo)劑，包括地塞米松、磷酸甘油、消炎痛、抗壞血酸磷酸鹽及IBMX等，均為培養(yǎng)純?cè)噭⊿igma公司）。BCIP/NBT染色液（北京中杉生物技術(shù)公司）。細(xì)胞流式儀（FACScalibur，BD公司）。細(xì)胞篩（BD公司）。

1.2 材料

腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的胃癌患者，共5例，均為男性，年齡49～64歲。手術(shù)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)腹膜黏連，進(jìn)行了大網(wǎng)膜部分切除術(shù)。

1.3 細(xì)胞的消化和接種

將腹膜剪至1 mm3左右的碎片，加入5倍體積的0.1%膠原酶Ⅰ型，37℃消化2 h。加入等體積的胎牛血清。用細(xì)胞篩（孔直徑70 μm）過(guò)濾去除組織殘?jiān)?00 r/min室溫離心6 min。計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并將細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的α-MEM中。血清為經(jīng)篩選的人MSC專用。將消化所得細(xì)胞分為2份，其一按5×103cells/cm2接種于培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)成纖維細(xì)胞-集落形成單位（Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F）；另一份按照1×106cells/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，用于培養(yǎng)MSC。

1.4CFU-F計(jì)數(shù)

培養(yǎng)2周后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。加入0.1%甲醛室溫固定10 min。PBS洗滌后加入瑞氏染液，室溫反應(yīng)15～30 min。PBS洗滌2次，計(jì)直徑大于5 mm的集落數(shù)。

1.5 細(xì)胞傳代

培養(yǎng)1周時(shí)，貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80%左右。吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，加入0.05%胰蛋白酶，室溫消化3 min。此時(shí)，少量細(xì)胞懸浮于消化液中，大部分細(xì)胞仍呈梭形并貼壁。加入胎牛血清中和后，離心收集細(xì)胞，并計(jì)活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞按6×103cells/cm2密度接種傳代。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

收集第3代細(xì)胞，PBS洗滌后分管，每管細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)。分別加入PE標(biāo)記的小鼠抗人CD29、CD44、CD73、CD31、CD34和CD45單克隆抗體，室溫避光反應(yīng)30 min。PBS洗滌后，F(xiàn)ACSCalibur收集數(shù)據(jù)，WinMdi 29軟件進(jìn)行分析。

1.7 成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)

收集第3代細(xì)胞，按照6×103cells/cm2接種，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，加入含有抗壞血酸磷酸鹽（50 μM）、磷酸甘油鈉鹽（10 mM）、地塞米松（100 nM）和10%FCS的α-MEM中，每3～4天換液1次。第14天去除培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加入BCIP/NBT染色液，室溫反應(yīng)10 min，以顯示細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性。

1.8 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定

細(xì)胞傳代培養(yǎng)達(dá)80%密度時(shí)，加入含地塞米松（1 μM）、IBMX（0.5 mM）、消炎痛（100 μM）和10% FCS的α-MEM。第3天換液1次，第8天進(jìn)行油紅O染色。即，細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定1 h，70%乙醇沖洗。用新鮮配制的染色液染色1～2 h，70%乙醇洗去過(guò)多染料，用蒸餾水清洗，鏡下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

腹膜組織消化后培養(yǎng)1周，部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭形；繼續(xù)培養(yǎng)至第10天時(shí)，細(xì)胞致密，呈草束狀分布（圖1）。

圖1 腹膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（光鏡，100×）Fig.1The morphological features of peritoneum cells (Light microscope,100×)

2.2CFU-F含量

將消化的細(xì)胞低密度培養(yǎng)，2周后形成大量的CFU-F，比例達(dá)0.574‰（0.26‰～0.84‰）。

2.3 表型分析

流式細(xì)胞分析表明，與人骨髓和脂肪源MSC相似，腹膜消化后培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞均一表達(dá)CD29、CD44和CD73，而不表達(dá)CD31、CD34和CD45，符合人MSC鑒定標(biāo)準(zhǔn)[5]（圖2）。

圖2 貼壁細(xì)胞的表型特征Fig.2Phenotype features of the adherent cells

2.4 分化功能分析

為進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入成骨和成脂肪誘導(dǎo)劑，2周和7 d后分別進(jìn)行堿性磷酸酶和油紅染色，大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)堿性磷酸酶活性；而成脂體系誘導(dǎo)后，細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞（圖3）。

圖3 細(xì)胞分化特性分析（光鏡，200×）。。Fig.3Analysis on the differentiation features (Light microscope,200×)

3 討論

MSC是一群具有成骨、成脂肪和成軟骨能力的干細(xì)胞，有研究表明，MSC甚至可以跨胚層向神經(jīng)細(xì)胞和肝臟細(xì)胞等分化[6]。更有趣的是，MSC具有低免疫原性和很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，異體骨髓MSC已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，用于移植物抗宿主病和克隆氏病的治療。此外，MSC已經(jīng)得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)，作為一個(gè)孤兒藥，用于Ⅰ型糖尿病的治療。

目前，人們已從多種組織中成功分離MSC，包括骨實(shí)質(zhì)[7]、胰腺[8]、血管和脂肪[9]等；甚至，外周血中也可能存在MSC[10]。然而，關(guān)于腹膜中是否存在MSC，相關(guān)報(bào)告較少。我們的實(shí)驗(yàn)證明，將腹膜消化后進(jìn)行接種，部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而且這種貼壁細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：①成纖維細(xì)胞樣；②表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD73，而不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記物（CD34和CD45）及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物（CD31）；③具有體外成骨和成脂肪能力。因此，這群細(xì)胞基本符合公認(rèn)的MSC鑒定標(biāo)準(zhǔn)[5]。更為重要的是，腹膜消化的細(xì)胞中，CFU-F比例超過(guò)萬(wàn)分之一，遠(yuǎn)高于人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CFU-F含量（1/100 000）[11]。因此，人腹膜中富含MSC，可作為特殊患者M(jìn)SC細(xì)胞治療的一個(gè)來(lái)源；或者，腹膜可作為一種特殊的含有干細(xì)胞的生物材料，用于組織工程化組織的構(gòu)建。

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The Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Peritoneum

ObjectiveTo observe the existence of mesenchymal stem cells(MSCs)in the human peritoneum and investigate their biological characteristics.MethodsThe peritoneum was harvested from five patients with gastric cancer. The peritoneum was cut into pieces and digested by collagenase typeⅠ.The harvested cells were seeded at a low density and the number of colony-forming unit-fibroblast was counted after culturing 14 days.The phenotypic features of the adherent cells were analyzed by flow cytometric techniques.Their osteogenesis and adipogenesis in vitro were evaluated by alkaline phosphatase and Oil Red O staining after 2 weeks of directional induction.ResultsThe adherent cells were fibroblast-like in morphology,and the proportion of CFU-F in the digested cells was 0.574‰(0.26‰-0.84‰).The expressions of CD29,CD44 and CD73 were positive while the expressions of CD31,CD34 and CD45 were negative.The cells were positive for alkaline phosphatase after osteogenic induction.Meanwhile,intracellular lipid droplets appeared after adipogenic induction and was shown positive by Oil-Red O staining.ConclusionMSCs are rich in human peritoneum and they might be served as a source for stem cells with natural scaffolds.

Mesenchymal stem cells;Peritoneum;Colony-forming unit-fibroblast

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0133－03

WU Limin,LIN Qingfan,LI Hang,LI Lihong,ZHANG Jinfan.
Department of Oncology,Putian College affiliated Hospital,The Affiliated Teaching Hospital of Fujian Medical University,Putian 351100,China.Corresponding author:WU Limin(E-mail：ptxywlm@126.com).

2011年4月26日，

2011年5月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.003

351100福建省莆田市福建醫(yī)科大學(xué)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院腫瘤科。

吳黎敏（E-mail：ptxywlm@126.com）。