人參皂甙Rg3對兔耳增生性瘢痕的影響

程麗英 唐夢遙 金蓉 張艷 孫寶珊 施耀明 張余光

人參皂甙Rg3對兔耳增生性瘢痕的影響

程麗英 唐夢遙 金蓉 張艷 孫寶珊 施耀明 張余光

目的研究在創(chuàng)傷早期應(yīng)用人參皂甙Rg3對兔耳增生性瘢痕形成的影響。方法建立12只新西蘭大耳白兔的增生性瘢痕模型。將兔耳創(chuàng)面分為6組：空白對照組（B組），生理鹽水注射組（T0組）以及治療組（T1～T4）。T1～T4各組于術(shù)后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮膚皮下注射不同濃度Rg3，其中T1組1 mg/mL，T2組2 mg/mL，T3組3 mg/mL，T4組4 mg/mL；每處創(chuàng)面注射劑量為0.1 mL，每日1次。大體觀察創(chuàng)面愈合時間和瘢痕增生情況。術(shù)后4周在瘢痕處取材，行HE、Masson染色，測量各組的HI指數(shù)，計算膠原纖維密度；ELISA法測定VEGF含量；檢測各標(biāo)本Hpr含量。結(jié)果T1～T4組HI較B組和T0組低（P＜0.05），T1～T4組間HI無差異（P＞0.05）；T1～T4組VEGF含量較B組和T0組低（P＜0.01），T1～T4組VEGF含量無差異（P＞0.05）；T1～T4組的膠原纖維密度低于B組和T0組（P＜0.05），T1～T4組膠原纖維密度無差異（P＞0.05）；T1～T4組Hpr含量較B組和T0組低（P＜0.05），T1～T4組Hpr含量無差異（P＞0.05）。結(jié)論在增生性瘢痕形成的早期階段，應(yīng)用人參皂甙Rg3能減少瘢痕局部新生血管的生成，減少瘢痕組織中膠原的合成，從而減輕增生性瘢痕的形成。為應(yīng)用人參皂甙Rg3治療增生性瘢痕提供了理論依據(jù)。

人參皂甙Rg3增生性瘢痕血管內(nèi)皮生長因子羥脯氨酸

增生性瘢痕是創(chuàng)傷治療的一大難題。增生性瘢痕的產(chǎn)生分為3個階段：炎癥反應(yīng)階段、增生性階段、塑形階段[1]。其病理機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為增生性瘢痕的產(chǎn)生與以下因素有關(guān)：增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，過多的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，局部增強(qiáng)的血管化反應(yīng)，減弱的細(xì)胞凋亡等[3]。增生性瘢痕的治療方法很多，主要是對增生和塑型階段的瘢痕進(jìn)行治療，但均不能取得滿意的效果。我們嘗試在增生性瘢痕形成的早期階段對其進(jìn)行干預(yù)，以預(yù)防增生性瘢痕的形成。

20-(R)人參皂甙Rg3是由人參中提取的一種單體成分，簡稱人參皂甙Rg3，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，減弱新生毛細(xì)血管的生成，抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的血管化作用等，從而能夠抑制過強(qiáng)的血管化反應(yīng)[3]；另有報道認(rèn)為，人參皂甙Rg3對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡[4]。因此，我們推測在增生性瘢痕形成的早期，局部應(yīng)用人參皂甙Rg3，可能具有預(yù)防或減弱增生性瘢痕形成的作用。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，觀察人參皂甙Rg3早期局部注射后兔耳創(chuàng)面的愈合情況和瘢痕增生情況，以及瘢痕組織細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的變化，為臨床應(yīng)用人生皂甙Rg3防治瘢痕增生提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要儀器與試劑

健康清潔級新西蘭大耳白兔12只（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物中心），體質(zhì)量2.5～3 Kg，兔耳健全，雌雄不限，單籠飼養(yǎng)；人參皂甙Rg3純品（純度98.63%，大連富生制藥有限公司），用生理鹽水配制成濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/ mL、4 mg/mL的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配，以漩渦振蕩器混勻；Tissue Protein Extraction Reagent（Thermo Scientific，美國）；Protease Inhibitor cocktail setⅠ（Calbiochem，美國）；BCA protein assay kit（Thermo Scientific，美國）；兔VEGF定量EIA試劑盒（RapidBio，美國）；酶標(biāo)儀（Thermo labsystems，美國）；離心機(jī)（Beckman，美國）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）；Image-Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernnetics，美國）；羥脯氨酸測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 增生性瘢痕動物模型的建立

實驗兔飼養(yǎng)1周后，根據(jù)Morris等[5]和李薈元等[6]建立的瘢痕動物模型法，麻醉后，嚴(yán)格無菌操作下，分別于兔耳腹側(cè)面近、中、遠(yuǎn)端水平的內(nèi)外側(cè)（避開可見血管）各形成1個直徑1 cm的創(chuàng)面，每耳6個創(chuàng)面，間隔≥1 cm，建立兔耳增生性瘢痕模型。術(shù)中切除兔耳皮膚及軟骨膜，保留耳軟骨，壓迫止血。術(shù)后以乙醇和生理鹽水清潔創(chuàng)面。

1.2.2 實驗分組、標(biāo)本取材及處理

將12只兔子隨機(jī)分為6組（n=2）。空白對照組（B組）：術(shù)后不進(jìn)行任何處理；生理鹽水注射組為（T0組）：術(shù)后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射生理鹽水；治療組：術(shù)后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射不同濃度人參皂甙Rg3，T1組為1 mg/mL，T2組為2 mg/mL，T3組為3 mg/mL，T4組為4 mg/mL。每處創(chuàng)面注射劑量為0.1mL，每日1次，持續(xù)28 d。大體觀察創(chuàng)面愈合和瘢痕增生情況。

術(shù)后4周，切取瘢痕組織標(biāo)本，每個標(biāo)本分為3份，1份標(biāo)本以4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，沿組織橫切面進(jìn)行切片，行HE染色及masson染色；1份標(biāo)本稱重，-80℃條件下保存，檢測VEGF含量；1份標(biāo)本稱重，-80℃條件下保存，檢測羥脯氨酸（Hpr）的含量。

1.3 結(jié)果檢測

1.3.1 大體觀察

察創(chuàng)面愈合情況，術(shù)后28 d，觀察各組增生性瘢痕的硬度、色澤、形態(tài)。

1.3.2 鏡下觀察

常規(guī)HE染色：采集標(biāo)本需包括瘢痕組織周邊5 mm的健康皮膚，4%中性甲醛固定24 h，乙醇脫水，石蠟包埋，沿瘢痕凸起最高點縱行切片，HE染色，鏡下觀察，低倍顯微標(biāo)尺測量，計算瘢痕增生指數(shù)HI（HI是用來測量真皮層增生程度的指標(biāo)）[5，7]，HI=瘢痕高度(SH)/健康皮膚高度(DH)。

膠原纖維密度：標(biāo)本石蠟包埋、Masson染色，膠原纖維呈綠色，每個切片隨機(jī)選取5個視野，共15個視野，利用Image-ProPlus圖像分析軟件計算膠原纖維密度[8]。

1.3.3 瘢痕組織VEGF含量測定

將各組織標(biāo)本稱重，根據(jù)組織塊大小加入適量的Tissue Protein Extraction Reagent和Protease Inhibitor（二者比例為100∶1），將組織塊減碎后勻漿、離心（10 000 r/min，30 min），提取樣本組織的總蛋白，用Bradford法測定所提樣本總蛋白的濃度，雙抗夾心ELISA法檢測各樣本中VEGF含量。步驟如下：于各反應(yīng)板孔中加入100 μL相應(yīng)的組織蛋白提取液，37℃溫育90 min；洗板，加入100 μL 1× Biotin，37℃溫育60 min；洗板，加入100 μL 1× HRP，37℃溫育30 min；洗板，每孔加入50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，37℃暗處溫育20 min；每孔加入100 μL終止液，輕輕混勻后立刻酶標(biāo)儀讀取OD450值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及各孔OD450值算出相應(yīng)標(biāo)本中VEGF濃度（VEGF在總蛋白中的濃度=相應(yīng)標(biāo)本中VEGF濃度/該標(biāo)本的總蛋白濃度）。

1.3.4 瘢痕組織羥脯氨酸（Hpr）含量測定

將各組標(biāo)本稱重，經(jīng)水解、調(diào)節(jié)pH值、蒸餾水稀釋、加活性炭混勻離心，測定吸光度，計算羥脯氨酸的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用SAS軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以“x±s”表示。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

各組創(chuàng)面均愈合良好，無感染。B組、T0組和T1～T4組的創(chuàng)面愈合時間分別為（18.75±1.42）d、（18.67±1.23）d、（18.17±1.64）d、（18.5±1.45）d、（17.75±1.60）d、（18.25±1.42）d，各組間無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后4周可見B組和T0組形成的增生性瘢痕最為顯著，瘢痕呈圓形，中央“小丘”樣凸起，色紅、質(zhì)硬，增生范圍不超過創(chuàng)緣；T1～T4組與前兩組比較，瘢痕增生程度較輕，色澤明顯較淺，表面較平坦，質(zhì)較軟（圖1）。

2.2 組織學(xué)變化

B組和T0組瘢痕組織真皮層明顯增厚，為周邊正常真皮層厚度的2～3倍，真皮層可見毛細(xì)血管、大量成纖維細(xì)胞增殖，膠原纖維多，排列紊亂，致密而粗大，可見旋渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)，結(jié)構(gòu)近似增生性瘢痕組織。與B組和T0組相比，T1～T4組真皮層厚度明顯較薄，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維致密度下降，膠原纖維束間有較大的空隙，排列較規(guī)則，呈多層水平向排列，新生血管、漩渦結(jié)節(jié)和膠原結(jié)節(jié)明顯減少（圖2）。

2.3 瘢痕組織VEGF含量

T1～T4組的VEGF含量較B組和T0組顯著降低（P＜0.05），B組與T0組VEGF含量無差異（P＜0.05），T1～T4各組之間的VEGF含量無差異（P＜0.05）（圖3）。

2.4 瘢痕增生指數(shù)HI

B組、T0組、T1～T4組HI值分別為2.04±0.08、2.06±0.07、1.76±0.09、1.74±0.06、1.72±0.11和1.72±0.13，B組與T0組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），T1～T4組的HI指數(shù)較B組及T0組低（P＜0.05），T1～T4組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 膠原纖維密度

B組和T0組之間膠原纖維密度無顯著性差異（P＞0.05），T1～T4組較B組和T0組明顯降低（P＜0.05），T1～T4組之間膠原纖維密度無顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。

2.6 瘢痕組織Hpr的測定

B組與T0組之間無差異（P＞0.05），T1～T4組的Hpr值均小于B組和T0組（P＜0.05）；T1～T4組之間無差異（P＞0.05）。

圖1 術(shù)后4周時兔耳增生性瘢痕大體觀察Fig.1Gross observation of each group 4 weeks after operation

圖2 組織學(xué)觀察（HE，100×）Fig.2Histological observation(HE,100×)

圖3 術(shù)后4周各組VEGF含量比較Fig.3VEGF content of each group 4 weeks after operation

圖4 組織學(xué)觀察（Masson，400×）Fig.4Histological observation(Masson,400×)

3 討論

增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制至今仍未明確，目前認(rèn)為主要與異常的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞外生長因子（PDGF、TGF-β和VEGF）的過度表達(dá)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過度增殖、局部血管化反應(yīng)的過度增強(qiáng)、膠原纖維合成的增加及異常沉積等有關(guān)。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活動性的減弱導(dǎo)致膠原降解減弱，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比例異常，也是增生性瘢痕形成的重要病理機(jī)制[1]。目前的治療方法主要有類固醇激素、抗代謝藥物、免疫抑制劑、放射療法和硅膠膜、手術(shù)切除等[9]，但均未達(dá)到滿意的效果。

人參皂甙Rg3是從人參中提取的一種單體成分，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了廣泛深入的研究，發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、減弱新生毛細(xì)血管的生成、抑制VEGF誘導(dǎo)的血管化作用，從而可抑制新生血管的過度形成[3]；人參皂甙Rg3還具有抗腫瘤作用，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[10-11]，且對骨髓、心、肺、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)無毒副作用[12]。劉鶴松等[4]發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3對人增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡。在增生性瘢痕形成的早期階段應(yīng)用人參皂甙Rg3，可能具有預(yù)防或者減輕瘢痕形成的作用，因此我們應(yīng)用兔耳增生性瘢痕模型對其進(jìn)行了研究，從組織病理學(xué)、VEGF含量、膠原纖維、羥脯氨酸含量的變化等角度研究人參皂甙Rg3局部應(yīng)用對增生性瘢痕的作用。

T1～T4組的創(chuàng)面愈合時間與B組、T0組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明局部應(yīng)用人參皂甙Rg3不會延遲創(chuàng)面愈合。T1～T4組與B組、T0組比較，瘢痕增生程度減輕，色澤明顯較淺，表面明顯平坦，質(zhì)較軟。

HI是表示瘢痕的增生情況及治療效果的指標(biāo)[5]，T1～T4組HI指數(shù)低于B組和T0組，說明在瘢痕形成早期應(yīng)用人參皂甙Rg3有效減輕了增生性瘢痕的形成；鏡下觀察T1～T4組新生血管少于B組和T0組；T1～T4組VEGF含量顯著低于B組和T0組，表明早期應(yīng)用人參皂甙Rg3能抑制兔耳增生性瘢痕中新生血管的形成，從而有望抑制瘢痕形成。Hpr是合成動物膠原蛋白的特有氨基酸，檢測其變化可以反映膠原合成情況。本實驗結(jié)果顯示，T1～T4組的Hpr含量低于B組和T0組，以T4組最低。Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T1～T4組的膠原纖維較B組和T0組的排列更整齊、更疏松，其膠原纖維密度較B組和T0組低。以上結(jié)果均表明，早期應(yīng)用人參皂甙Rg3能抑制兔耳增生性瘢痕中膠原的合成，改善瘢痕組織細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，使其更接近正常皮膚；T1～T4組間的以上各測量指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明人參皂甙Rg3抑制瘢痕形成的作用，并未隨濃度升高而增加，可能與人參皂甙Rg3飽和溶解度較低有關(guān)。

本實驗結(jié)果初步顯示在兔耳瘢痕形成的早期階段局部應(yīng)用人參皂甙Rg3，可以減輕增生性瘢痕的形成，推測其可能通過以下途徑抑制瘢痕增生：①抑制VEGF誘導(dǎo)的局部新生血管的形成，抑制過強(qiáng)的血管化反應(yīng)；②直接抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的生長增殖或誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少膠原的合成和分泌。兩者中以抑制VEGF誘導(dǎo)的局部新生血管形成為主要作用機(jī)制。

本實驗結(jié)果僅是一個初步的探索，人參皂甙Rg3真正應(yīng)用于臨床，尚需在劑量、給藥途徑等多方面進(jìn)行更為深入的研究。

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Effets of Ginsenoside Rg3 on the Hypertrophic Scar of Rabbit Ears

CHENG Liying,TANG Mengyao,JIN Rong, ZHANG Yan,SUN Baoshan,SHI Yaoming,ZHANG Yuguang.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author: ZHANG Yuguang(E-mail:zhangyg16@126.com).

ObjectiveTo investigate the effets of Ginsenoside Rg3 on the hypertrophic scar of rabbit ears in the early phase of scarring.MethodsThe rabbit ear model was established on the 12 New Zealand white rabbits.The rabbits were divided into 6 groups(n=2):group B(control group),group T0(only NS),group T1(GS-Rg3 1 mg/mL),group T2(GSRg3 2 mg/mL),group T3(GS-Rg3 3 mg/mL),group T4(GS-Rg3 4 mg/mL).0.1 mL GS-Rg3 with different concentration were injected at wound in each group from 1 day after operation.The wounds healing times and hypertrophic scar were observed.Scar samples were harvested 28 days after operation.The calculation of HI index and collagen density by HE, Masson staining,VEGF content was detected by ELISA and Hpr content was also detected.ResultsThe expression of VEGF,HI index,collagen density and the Hpr content were significantly lower in group T1－T4 compared with group B and group T0(P＜0.05).There were no significantly differences between group T1-T4.ConclusionTopical injection of ginsenoside Rg3 in the early phase of trauma can inhibit the activity of angiogenesis and the formation of collagen in a rabbit ear model,thus reduced hypertrophic scar formation.The findings of this study may have clinical implications on the management of human hypertryphic scars.

Ginsenoside Rg3;Hypertrophic scar;VEGF;Hpr

R619+.6

A

1673－0364（2011）02－0096－04

2011年1月22日；

2011年3月15日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.009

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

張余光（E-mail:zhangyg16@126.com）。