人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)的研究

劉春曉 吳歡歡 馬慧雨 康寧 曹誼林 肖苒 尹寧北

·論著·

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)的研究

劉春曉 吳歡歡 馬慧雨 康寧 曹誼林 肖苒 尹寧北

目的觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）體外共培養(yǎng)對hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影響。方法分離鑒定hBMSCs和hUVECs，將hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長特性和細(xì)胞相容性，Matrigel實(shí)驗(yàn)觀察共培養(yǎng)對hUVECs體外血管形成能力的影響。將hBMSCs成骨誘導(dǎo)7 d后，茜素紅染色觀察共培養(yǎng)對其成骨分化能力的影響。結(jié)果hBMSCs與hUVECs體外共培養(yǎng)細(xì)胞相容性良好，Matrigel實(shí)驗(yàn)顯示共培養(yǎng)組形成的毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)較單一細(xì)胞組多。成骨誘導(dǎo)的hBMSCs中，共培養(yǎng)組茜素紅染色陽性，單一細(xì)胞組茜素紅染色陰性。結(jié)論hBMSCs與hUVECs具有良好的細(xì)胞相容性，在共培養(yǎng)體系中，未誘導(dǎo)的hBMSCs能促進(jìn)形成毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)，已成骨誘導(dǎo)的hBMSCs成骨礦化能力增強(qiáng)。

組織工程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)

組織工程骨的預(yù)制技術(shù)為骨缺損的修復(fù)提供了新的方法。但是體外構(gòu)建的單純組織工程骨，移植入體內(nèi)后依靠組織液滲透僅能營養(yǎng)100 μm以內(nèi)的細(xì)胞[1]，中央的細(xì)胞供血和供氧受到限制，出現(xiàn)成骨不良及成骨質(zhì)量不佳等問題，使得組織工程骨無法有效修復(fù)體積較大的骨缺損。因此，血管化是解決組織工程骨臨床應(yīng)用問題的關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)，在骨缺損修復(fù)的過程中，成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在著密切的聯(lián)系[2]。本實(shí)驗(yàn)將成骨誘導(dǎo)后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）直接共培養(yǎng)，觀察兩種細(xì)胞的生物相容性，探討hUVECs對hBMSCs成骨作用及hBMSCs對hUVECs成血管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（G&E公司，瑞典）；胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）；肝素、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、PBS緩沖液（Sigma公司，美國），EGM-2（Lonza公司，瑞士）；鼠抗人OPN（Abcam公司，英國）；流式抗體CD31-FITC、CD34-PE、FITC和PE同型對照（BD公司，美國）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（Accuri公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；骨髓血與臍帶來源于無全身性疾病的臨床志愿者。

1.2 hBMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 hBMSCs的分離純化和擴(kuò)增

采用密度梯度離心法分離hBMSCs，將經(jīng)過抗凝處理的骨髓血緩慢加入含有等體積Ficoll分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min，吸取中間乳白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，PBS沖洗2遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM-LG培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青、鏈霉素），反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。7～10 d后待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，按1×104cells/cm2密度接種于新的培養(yǎng)瓶中。本實(shí)驗(yàn)使用第3～5代的hBMSCs。

1.2.2 HBMSCs的多向誘導(dǎo)分化

1.2.2.1 成骨誘導(dǎo)

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)預(yù)置3枚1 cm×1 cm蓋玻片，加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM-HG培養(yǎng)基，10%胎牛血清，10-8mmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L抗壞血酸，1%青、鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3遍，取出蓋玻片，進(jìn)行骨橋蛋白（Osteopetin，OPN）免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。取第3代未成骨誘導(dǎo)的hBMSCs爬片作為陰性對照。

1.2.2.2 成脂肪誘導(dǎo)

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加入2 mL成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM-HG培養(yǎng)基，10%胎牛血清，0.5 μM氫化可的松，0.5 μM IBMX，60 μM消炎痛，10 μg/mL胰島素，1%青、鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)10 d后，鈣-福爾馬林固定10 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3次，60%異丙醇處理2 min，加入油紅O染液，置于脫色搖床震蕩30 min后，鏡下觀察。

1.3 hUVECs的原代培養(yǎng)和鑒定

1.3.1 hUVECs的原代分離和擴(kuò)增

無菌條件下取新生兒臍帶（長約20 cm），找出臍靜脈，注入0.1%膠原酶Ⅱ，置于預(yù)熱PBS燒杯中，37℃孵育5 min，收集消化液，注入EGM-2培養(yǎng)基，再次沖洗靜脈管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入EGM-2培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞，隔天換液，細(xì)胞生長融合至80%～90%時(shí)，按上述方法傳代。本實(shí)驗(yàn)使用第2～3代的hUVECs。

1.3.2 hUVECs的表面標(biāo)志物檢測

取第2代hUVECs，PBS沖洗3遍，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸，樣品管和對照管各加入100 μL細(xì)胞懸液，含1×106個(gè)細(xì)胞。樣品管加鼠抗人熒光標(biāo)記單克隆抗體CD31-FITC、CD34-PE各10 μL，對照管加入10 μL FITC或PE標(biāo)記的鼠IgG1同型對照抗體作為陰性對照，4℃避光孵育30 min。PBS重懸，2 000 r/min離心3 min，重復(fù)洗滌3遍。1%多聚甲醛固定，定容至200 μL，4℃避光保存，次日流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.4 hBMSCs和hUVECs的直接共培養(yǎng)

1.4.1 Matrigel測定共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力

將Matrigel置于4℃過夜融解，取30 μL加入96孔板，37℃孵育1 h，使Matrigel聚合成膠。取未誘導(dǎo)的hBMSCs與hUVECs，分別消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/mL，設(shè)立1個(gè)實(shí)驗(yàn)組及2個(gè)對照組，每組復(fù)設(shè)5孔，實(shí)驗(yàn)組于96孔板每孔內(nèi)各加入100 μL hBMSCs與hUVECs細(xì)胞懸液，使hBMSCs與hUVECs比例為1∶1，對照組僅加入100 μL hBMSCs或100 μL hUVECs，用培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL。實(shí)驗(yàn)過程保持冰上操作。每2 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測hBMSCs對hUVECs成血管能力的影響。

1.4.2 茜素紅染色檢測共培養(yǎng)對成骨誘導(dǎo)的hBMSCs功能的影響

取成骨誘導(dǎo)7 d的hBMSCs與hUVECs，分別消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL，于6孔板每孔內(nèi)各加入1 mL hBMSCs與hUVECs細(xì)胞懸液，使hBMSCs與hUVECs比例為1∶1，以單純hBMSCs為對照組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換為不含成骨誘導(dǎo)成分的培養(yǎng)基，隔天換液。倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)和生長情況。7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS輕輕沖洗3次，每孔加入1 mL 1%茜素紅-Tris-HCL（pH 4.7），37℃孵育30 min，用PBS沖洗數(shù)次，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

2.1.1 hBMSCs原代及傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞接種48 h后，可見hBMSCs在培養(yǎng)瓶底散在分布，伸展成梭形，與周圍圓盤狀血細(xì)胞相互混雜。4 d后，可見細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣集落生長。5～10 d，細(xì)胞生長迅速，形成大集落，呈漩渦狀排列。各個(gè)集落之間逐漸融合，不發(fā)生接觸抑制，集落生成細(xì)胞生長速度顯著快于散在的細(xì)胞。傳代后，細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，形態(tài)更加單一，體積增大呈紡錘型，細(xì)胞排列有規(guī)則的方向性（圖1）。

圖1 原代hBMSCs體外培養(yǎng)第14天（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1Primary cultured hBMSCs 14 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.1.2 OPN染色鑒定hBMSCs成骨分化能力

hBMSCs在體外成骨誘導(dǎo)7 d，細(xì)胞體積變大，形態(tài)變?yōu)槎噙呅危舜螅巳是逦?xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞外基質(zhì)（Extra Cellular Matrixc，ECM）分泌旺盛，局部細(xì)胞相互連接成膜狀。OPN免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見胞漿中有棕色顆粒，為陽性，未成骨誘導(dǎo)的hBMSCs未見有陽性表達(dá)（圖2）。

圖2 體外成骨誘導(dǎo)7 d（OPN染色，倒置相差顯微鏡，100×）Fig.2Seven days after induced osteogenesis (OPN STAINING,Inverted phase contrast microscope,100×)

2.1.3 油紅O染色鑒定hBMSCs成脂肪分化能力

hBMSCs加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積變大，逐漸由長梭形變?yōu)槎噙呅危瑱E圓形等脂肪細(xì)胞樣形態(tài)，胞漿內(nèi)可見明顯脂肪滴，且細(xì)胞增殖明顯減慢。油紅O染色可見胞漿內(nèi)呈紅色，為陽性，說明細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，對照組未見陽性表達(dá)（圖3）。

2.2 hUVECs的形態(tài)觀察及表面標(biāo)志物鑒定

圖3 體外成脂肪誘導(dǎo)10 d（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.3hBMSCs 10 days after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,100×)

hUVECs為單層貼壁生長，大部分在原代分離24 h后完全貼壁，相差顯微鏡下見細(xì)胞成團(tuán)或散在貼附在培養(yǎng)瓶上，呈梭形或多角形，胞核橢圓居中，互不重疊。3～5 d后融合，低倍鏡下呈典型的鋪路石樣外觀（圖4）。流式細(xì)胞儀檢測CD31陽性率為92.6%，CD34陽性率為28.6%，提示為成熟內(nèi)皮細(xì)胞（圖5）。

圖4 原代hUVECs體外培養(yǎng)4 d（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.4Primary culture hUVECs 4 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

圖5 流式細(xì)胞儀檢測hUVECs表面標(biāo)志Fig.5Flow cytometry analysis of endothelial phenotype of hUVECs

2.3 hBMSCs與hUVECs共培養(yǎng)

2.3.1 共培養(yǎng)大體形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見在直接接觸培養(yǎng)條件下，兩種細(xì)胞均貼壁生長并維持各自細(xì)胞形態(tài)，hBMSCs呈長梭形，有粗大的角狀突起，體積較大; hUVECs呈卵圓形，類似鵝卵石狀，體積較小。隨著時(shí)間延長，相鄰細(xì)胞彼此貼靠融合，相互交織生長，未發(fā)生接觸抑制，無排斥、吞噬等現(xiàn)象（圖6）。

圖6 hBMSCs與hUVECs以1∶1共培養(yǎng)2 d（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.6hBMSCs 2 days after directly co-cultur with hUVECs in a ratio of 1∶1 (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.2 Matrigel血管形成能力檢測

接種即刻可見細(xì)胞呈圓形分散在Matrigel內(nèi)，2～3 h后可見細(xì)胞伸出偽足向周圍擴(kuò)散，4 h后可見細(xì)胞間相互銜接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即管腔樣毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，提示Matrigel實(shí)驗(yàn)陽性，說明hUVECs保持成血管能力。共培養(yǎng)組形成了廣泛的管腔樣毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖7），比單純hUVECs組（圖8）形成的毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密粗厚，單純hBMSCs組僅有少量不連續(xù)的管腔樣結(jié)構(gòu)（圖9），提示共培養(yǎng)的hUVECs血管形成能力優(yōu)于單一細(xì)胞培養(yǎng)。

圖7 hBMSCs與hUVECs以1∶1接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.7hBMACs and hUVECs 4 hours after seeding onto Matrigel coated wells (Inverted phase contrast microscope,40×)

圖8 hUVECs單獨(dú)接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.8hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖9 hBMSCs單獨(dú)接種于Matrigel后4 h（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.9hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.3 hBMSCs茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)的hBMSCs與hUVECs共培養(yǎng)7 d后可見實(shí)驗(yàn)組于皿底有白色礦化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)中心細(xì)胞重疊，呈放射狀排列，周邊細(xì)胞稀疏，茜素紅染色為深紅色，提示ECM中出現(xiàn)大量鈣鹽沉積，包裹細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)。單純hBMSCs對照組未出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色陰性（圖10）。

圖10 成骨誘導(dǎo)7 d的hBMSCs與hUVECs共培養(yǎng)7 d后（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.10hBMSCs 7 days with hUVECs co-culture after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,40×)

3 討論

組織工程骨為臨床骨缺損的治療提供了新的思路。骨組織工程技術(shù)應(yīng)用自體種子細(xì)胞與可降解支架材料結(jié)合，可構(gòu)建與人體骨組織結(jié)構(gòu)相同的活性骨組織，修復(fù)機(jī)體骨缺損，同時(shí)避免了臨床上現(xiàn)行的自體骨移植技術(shù)“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的弊端，以及異體骨移植的感染、免疫排斥等副作用[3]。BMSCs因其多向分化能力以及成骨分化潛能成為骨組織工程重要的種子細(xì)胞[4-5]。目前，體外構(gòu)建的單純組織工程骨是種子細(xì)胞和生物材料的復(fù)合體，本身沒有營養(yǎng)來源，宿主血管長入的速度不能滿足種子細(xì)胞的營養(yǎng)和供氧需求，因此，形成的新生骨的數(shù)量和質(zhì)量均不能滿足臨床修復(fù)大范圍骨缺損的需要。

血管化在骨損傷修復(fù)和再生過程中是極為重要的，新生血管不僅是運(yùn)送氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及運(yùn)走代謝廢物的途徑，它還是參與骨修復(fù)調(diào)控的信號分子、生長因子和細(xì)胞運(yùn)輸通過的重要通道。研究發(fā)現(xiàn)，組織工程骨的血管化程度與新骨形成的數(shù)量呈正相關(guān)，同時(shí)血管能運(yùn)走生物材料代謝物，使成骨速率與材料降解率達(dá)到同步[6]。因此，組織工程骨的有效血管化成為骨組織工程邁向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，組織工程骨血管化方法通常包括：將血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨及其前體細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)[7]，添加促血管生成的生長因子[8]，將血管束植入組織工程骨[9]，動(dòng)靜脈吻合環(huán)繞組織工程骨[10]等。研究表明，上述方法能提高組織工程骨構(gòu)建的效率和骨缺損的修復(fù)效果。

本實(shí)驗(yàn)以hUVECs與未誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)的hBMSCs共培養(yǎng)，有效地模擬了體內(nèi)微環(huán)境。研究結(jié)果顯示，hBMSCs與hUVECs具有良好的細(xì)胞相容性，未誘導(dǎo)的hBMSCs能協(xié)助并促進(jìn)hUVECs形成毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)；已成骨誘導(dǎo)的hBMSCs在使用成骨誘導(dǎo)因子的情況下加入hUVECs，可以維持成骨表型，成骨活性和礦化形成能力增強(qiáng)。其機(jī)制可能是：①hBMSCs可表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF在血管發(fā)生和形成過程中有重要的作用[11]，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管形成能力[12]；②未誘導(dǎo)的hBMSCs在與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，有部分向血管肌層細(xì)胞分化，協(xié)助內(nèi)皮細(xì)胞形成血管管腔[13]，有助于新生血管的穩(wěn)定，增強(qiáng)其長期存活率[14]；③hBMSCs促內(nèi)皮細(xì)胞分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP-2）[15]，促進(jìn)已成骨誘導(dǎo)的hBMSCs進(jìn)一步向成骨細(xì)胞分化[16-17]。但是，兩種細(xì)胞在直接接觸培養(yǎng)時(shí)通過什么途徑形成功能相互促進(jìn)，以及各誘導(dǎo)因子發(fā)揮作用的機(jī)制，目前仍未闡明，還有待進(jìn)一步探討和研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，直接共培養(yǎng)可分別提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管功能和成骨誘導(dǎo)的BMSCs的成骨礦化能力。BMSCs-支架復(fù)合物體外聯(lián)合血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)使組織工程骨預(yù)血管化，可以為種子細(xì)胞提供正常的營養(yǎng)和生長調(diào)控，是骨組織工程血管化的理想方法。

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Experimental Study on the Co-Culture of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Vitro

LIU Chunxiao1,WU Huanhuan1,MA Huiyu2,KANG Ning1,CAO Yilin1,XIAO Ran1,YIN Ningbei1.1 Plastic Surgery Hospital（Institute）,CAMS,PUMC,Beijing 100041,China;2 Dental Hospital,Jiamusi University,Heilongjiang 154007,China.Corresponding author:YIN Ningbei(E-mail:yin_nb@126.com).

ObjectiveTo observe the effects of co-culture of human bone marrow mesenchymal stromal cells(hBMSCs) and human umbilical vein endothelial cells(hUVECs)in vitro on the osteogenesis and angiogenesis respectively.Methods Isolated and identified hBMSCs and hUVECs were directly co-cultured by a ratio of 1∶1.Growth and compatibility of the cells were observed with inverted phase contrast microscope.Matrigel experiment was used to test the ability of hUVECs to form networks of capillary-like structures under co-culture.After 7 days of osteogenic induction,the effect of co-culture on the osteogenesis of hBMSCs was assessed by Alizarin-Red staining.ResultsThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.hUVECs co-cultured with hBMSCs exhibited denser microcapillary-like networks in Matrigel experiment than hUVECS.Osteogenic-induced hBMSCs co-cultured with hUVECs showed positive by Alizarin-Red staining,while it was negative in osteogenic-induced hBMSCs.ConclusionThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.In the coculture system,the ability of hUVECs to form microcapillary-like networks can be enhanced,so as the calcification activity of osteogenic-induced hBMSCs.

Tissue engineering;Bone marrow mesenchymal stromal cells;Umbilical vein endothelial cells;Co-culture

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）02－0065－06

2011年2月1日；

2011年3月7日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.002

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（D09080703660901）。

100041北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院（劉春曉，吳歡歡，曹誼林，肖苒，尹寧北）；154007黑龍江省佳木斯市佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院（馬慧雨）。

尹寧北（E-mail:yin_nb@126.com）。