CdSe@ZnS量子點在果蠅及其幼蟲體內的分布

劉 慧 汪 冰 王 卓 李 明 康艷杰,3秘曉林 余笑寒 豐偉悅

1 (中國科學院高能物理研究所納米生物效應與安全性重點實驗室和核分析技術重點實驗室 北京 100049)

2 (煙臺大學環境與材料工程學院 煙臺 264005)

3 (鄭州大學化學系 鄭州 450001)

4 (中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800)

納米材料因其小尺寸效應而易穿過各種生物體屏障(如血肺屏障、血腦屏障、皮膚屏障等)，對呼吸系統、心血管系統、中樞神經系統和免疫系統等造成影響[1,2]。胎盤屏障是母嬰重要屏障，能防御外來有害物質進入胚胎，保證胎兒在母體內正常發育。納米材料跨越胎盤屏障的能力、對胚胎早期的組織分化、發育和子代未來健康的潛在影響，是納米安全性研究的重要內容，受到廣泛關注[3,4]。最近，Bai等[5]報道碳納米管暴露對雄性小鼠的生殖系統產生一定的影響，引起了人們對納米材料生殖系統安全性研究的重視，但目前有關納米材料是否能通過母體轉運至胚胎還所知甚少。

量子點是新興的熒光標記材料，與傳統有機染料和熒光蛋白相比，其熒光強度高、抗光漂白能力強和發射光譜窄[6]，在活細胞熒光標記、腫瘤細胞示蹤、組織成像及動物活體成像等生物領域展現出廣泛的應用前景[7?9]。隨著量子點的廣泛應用，其生物安全性問題引起了科學家的廣泛關注[10]。

果蠅體型小，生長周期短(10天左右一代)，繁殖效率高、胚胎發育速度快、能完全變態發育，是發育生物學研究的重要模式生物[11?14]。Liu等[12]研究了碳納米管對果蠅存活率和運動行為的影響，發現成蟲直接暴露于碳納米管粉末后，運動能力下降且死亡率上升。

目前，檢測量子點在活體組織及細胞內定位的手段主要有激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)、多光子顯微鏡、核磁共振等[15?17]。但是，利用LSCM檢測量子點在生物體內分布還存在一定困難，如檢測時通常會受到生物體自發熒光的干擾及生物體大小的限制(可適用于數μm的活體生物)；多光子顯微鏡分辨率略低，且費用昂貴。同步輻射微束X射線熒光分析(μ-SRXRF)具有檢出限低(50–100 ng/g)、空間分辨率高(0.5–1 μm)及多元素檢測等特點[18]。目前已用于納米毒理學研究領域。Wang等[19]研究了Fe2O3納米顆粒經嗅神經通路向腦組織中的轉移，Gao等[20]研究了銅納米顆粒在線蟲體內的分布。

本文利用μ-SRXRF技術結合LSCM技術研究了果蠅成蟲攝取量子點后，在暴露成蟲和子代一期幼蟲體內的轉運和分布，測定了成蟲體內的 Cd、Zn、Se元素，并對暴露成蟲所產的一期幼蟲進行LSCM成像分析，探討量子點從果蠅母體轉運到子代的能力。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

激光掃描共聚焦顯微鏡(美國PerkinElmer有限公司)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71, 美國Olympus有限公司)；高功率數控超聲波清洗器(KQ-500KDE, 昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(Acculab ALC-210.4, 北京賽多利斯科學儀器有限公司)；渦旋儀(CS-H1型，北京博勵陽科技公司)；移液器(P型, 北京吉爾森科技有限公司)；Milli-Q Integral 3水純化系統；CdSe@ZnS納米粉體，尺寸3 nm，購于天津游瑞量子點有限公司；動物為w1118突變體果蠅。

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒培養基的制備

稱取一定量的 CdSe@ZnS量子點配制成濃度為100 μg·g–1的水溶液，超聲分散1–2 h。取果蠅標準培養基1.8 g于空的玻璃管中，微波爐高火加熱10 s后迅速加入超聲好的 CdSe@ZnS量子點母液200 μL，渦旋混勻，制備成含有10 μg·g–1量子點的果蠅培養基，室溫冷卻后備用。

1.2.2 μ-SRXRF分析

收集新生未交配的雌、雄性果蠅各100只，分別暴露于含有10 μg·g–1CdSe@ZnS的培養基中，置于25oC的恒溫培養箱中(濕度為40%–60%、光照周期L:D = 14:10)，暴露5天。結束后收集果蠅成蟲，置于CO2環境中將其麻醉，用超純水多次清洗，用毛刷將其放到聚碳酸酯膜上(Maylar)，經液氮冷凍后，室溫自然晾干，待μ-SRXRF分析用。

μ-SRXRF測量在上海光源BL15U實驗站(中國科學院上海應用物理研究所)上進行。儲存環電子束流能量3.5 GeV，最大束流強度300 mA，利用該實驗站的10 keV單色X射線，光斑尺寸10 μm×10 μm，果蠅成蟲掃描步長為20 μm×100 μm，單點掃描時間15 s。XRF能譜分析用Igor Pro 6.0軟件包(美國Wave metrics公司)，所得各元素的特征X射線強度用康普頓散射強度歸一，以消除樣品厚度、樣品不均勻性及光強變化等因素對計數的影響。

1.2.3 激光掃描共聚焦實驗

果蠅暴露結束后，把雌雄果蠅轉移到標準培養基中，進行交配試驗。收集交配后所產子一代一期幼蟲，用超純水清洗，放在薄的蓋玻片上，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果與討論

2.1 CdSe@ZnS量子點的熒光譜

圖1(a)為粒徑 3 nm的CdSe@ZnS量子點的熒光顯微譜，激發光為波長390 nm的紫外光，產生較強的綠色熒光，熒光峰值波長為520 nm，發射峰的半峰寬為33 nm，熒光強度高達2838。由圖1(b)，CdSe@ZnS量子點顆粒為圓形，尺寸均一，并發出明亮的熒光，與其熒光光譜圖相符。

圖1 390 nm UV激發下CdSe@ZnS量子點(3 nm)熒光光譜圖(a)和熒光顯微鏡照片(b)Fig.1 Fluorescence spectrum(a) and fluorescence image (b) of 3 nm CdSe@ZnS QDs under 390 nm UV.

2.2 CdSe@ZnS量子點的成蟲體內分布

圖2為暴露于CdSe@ZnS量子點的果蠅成蟲體內的Cd、Se和Zn 微區分布。Cd、Se、Zn均富集于成蟲尾部的腸道和生殖系統，這三種元素的共位性表明CdSe@ZnS量子點蓄積在這些部位。

2.3 CdSe@ZnS量子點經母體向子代的轉運

圖3為果蠅成蟲攝取CdSe@ZnS量子點后，所產子代一期幼蟲的LSCM成像圖片。由圖3(b)可見，果蠅成蟲暴露量子點后，其一期幼蟲體內可檢測到明顯的熒光；比較圖 3(a)和3(c)，發現量子點主要富集于幼蟲生殖系統(精巢)內。然而在未暴露量子點的空白對照組中，所產一期幼蟲在激光掃描共聚焦顯微鏡下未觀察到明顯的熒光信號，表明CdSe@ZnS量子點能通過果蠅母體轉運至子代。

圖2 暴露于CdSe@ZnS量子點的果蠅成蟲體內Cd、Se和Zn微區分布，由μ-SRXRF測得Fig.2 μ-SRXRF elemental mapping of Cd, Se and Zn in the CdSe@ZnS QDs-exposed adult drosophila.

圖3 LSCM成像觀察量子點在果蠅一期幼蟲體內的分布(a) 一期幼蟲的明場照片, (b) 一期幼蟲的熒光照片, (c) 一期幼蟲的結構圖Fig.3 LSCM images of stage-1 larva produced by the CdSe@ZnS QDs-exposed drosophila parents.(a) light field image, (b) fluorescence image, (c) structure of the stage-1 larva

3 結語

利用μ-SRXRF結合LSCM成像技術研究了經口暴露的 CdSe@ZnS量子點在果蠅成蟲及子代一期幼蟲體內的微區分布。μ-SRXRF分析表明，果蠅成蟲攝取CdSe@ZnS量子點后，量子點主要富集在腸道和生殖道部位。LSCM研究表明，暴露成蟲所產一期幼蟲的生殖部位(精巢)有明顯的熒光增強信號。上述結果表明，量子點暴露對果蠅母體到子代的轉運及生殖系統可能產生潛在的影響。同時，μ-SRXRF技術的應用也為納米顆粒在活體內轉運研究提供了很好的分析手段。

1 Zhu M T, Feng W Y, Wang Y, et al. Particokinetics and extrapulmonary translocation of intratracheally instilled ferric oxide nanoparticles in rats and the potential health risk assessment[J]. Toxicol Sci, 2009, 107(2): 342–351

2 Saunders M. Transplacental transport of nanomaterials[J]. Nanomed Nanobiotechnol, 2009, 1(6): 671–684

3 Semmler-Behnke M, Fertsch S, Schmid G, et al. Uptake of 1.4 nm versus 18 nm gold nanoparticles in secondary target organs is size dependent in control and pregnant rats after intratrecheal or intravenous application[C]. In: EuroNanoForum-Nanotechnology in Industrial Applications. Luxembourg: European Communities, 2007, 102–104

4 Wick P, Malek A, Manser P, et al. Barrier Capacity of Human Placenta for Nanosized Materials[J]. Environ Health Perspect, 2010, 118(3): 432–436

5 Bai Y H, Zhang Y, Zhang J P, et al. Repeated administrations of carbon nanotubes in male mice cause reversible testis damage without affecting fertility[J]. Nat Nanotech, 2010, 5(9): 683–689

6 Carrillo-Carrion C, Cardenas S, Simonet B M, et al. Quantum dots luminescence enhancement due to illumination with UV/Vis light[J]. Chem Commun, 2009, (35): 5214–5226

7 Ballou B, Lagerholm B C, Ernst L A, et al. Noninvasive imaging of quantum dots in mice[J]. Bioconjugate Chem, 2004, 15(1): 79–86

8 Gao X H, Cui Y Y, Levenson R M, et al. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots[J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(8): 969–976

9 Larson D R, Zipfel W R, Williams R M, et al. Watersoluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo[J]. Science, 2003, 300(5624): 1434–1436

10 Hardman R. A toxicologic review of quantum dots: Toxicity depends on physicochemical and environmental factors[J]. Environ Health Perspect, 2006, 114(2): 165–172

11 Landenberger A, Kabil H, Harshman L G, et al. Biotin deficiency decreases life span and fertility but increases stress resistance in Drosophila melanogaster[J]. J Nutr Biochem, 2004, 15(10): 591–600

12 Liu X Y, Vinson D, Abt D, et al. Differential Toxicity of Carbon Nanomaterials in Drosophila: Larval Dietary Uptake Is Benign, but Adult Exposure Causes Locomotor Impairment and Mortality[J]. Environ Sci Technol, 2009, 43(16): 6357–6363

13 Leeuw T K, Reith R M, Simonette R A, et al. Singlewalled carbon nanotubes in the intact organism: Near-IR imaging and biocompatibility studies in Drosophila[J]. Nano Lett, 2007, 7(9): 2650–2654

14 Cohen C A, Katfakis J A, Kurnick M D, et al. Cerium oxide nanoparticles reduce free radical-mediated toxicity in drosophila melanogaster[J]. Free Radical Bio Med, 2007, 43: S68

15 Huh Y M, Jun Y W, Song H T, et al. In vivo magnetic resonance detection of cancer by using multifunctional magnetic nanocrystals[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127(35): 12387–12391

16 Stroh M, Zimmer J P, Duda D G, et al. Quantum dots spectrally distinguish multiple species within the tumor milieu in vivo[J]. Nat Med, 2005, 11(6): 678–682

17 Matsuno A, Itoh J, Takekoshi S, et al. Three-dimensional imaging of the intracellular localization of growth hormone and prolactin and their mRNA using nanocrystal (Quantum dot) and confocal laser scanning microscopy techniques[J]. J Histochem Cytochem, 2005, 5(7): 833–838

18 Wang H J, Wang M, Wang B, et al. Quantitative imaging of element spatial distribution in the brain section of a mouse model of Alzheimer’s disease using synchrotron radiation X-ray fluorescence analysis[J]. J Anal At Spectrom, 2010, 25: 328–333

19 Wang B, Feng W Y, Wang M, et al. Transportation of intranasal instillation of fine Fe2O3particles in brain: microdistribution, chemical states, and histopathological observation[J]. Biol Trace Elem Res, 2007, 118(3): 233–243

20 Gao Y X, Liu N Q, Chen C Y, et al. Mapping technique for biodistribution of elements in a model organism, Caenorhabditis elegans, after exposure to copper nanoparticles with microbeam synchrotron radiation X-ray fluorescence [J]. J Anal Atom Spectrom, 2008, 23(8): 1121–1124