帕米磷酸鈉對成骨不全成骨細胞和成纖維細胞增殖分化的研究

李公超 任秀智 王延宙 魯艷芹 徐 超 韓金祥

1.山東省醫學科學院山東省醫藥生物技術研究中心，山東省現代醫用藥物與技術重點實驗室,山東 濟南 250062；2。天津醫院，天津 300211；3 山東省省立醫院,山東 濟南 250033

雙磷酸鹽是抑制破骨細胞活性的強有力的骨吸收抑制劑，在臨床上被廣泛應用于骨質疏松，骨肉瘤等病理性骨量丟失疾病。最近幾年雙磷酸鹽類藥物開始應用于成骨不全的臨床治療中。成骨不全（Osteogenesis Imperfecta）是一種由于間充質組織發育不全，膠原形成障礙而造成的先天性遺傳性疾病，其發病率大約是1/ 10000[1]。其主要臨床表現是青少年骨質疏松，骨脆性增加，易于骨折。目前針對成骨不全癥手術治療后的藥物輔助治療主要是采用雙磷酸鹽類藥物。目前對雙磷酸鹽類藥物作用機理的研究大多針對正常的成骨細胞或者成骨細胞系，本實驗采用體外原代培養的成骨不全患者成骨細胞和成纖維細胞，取髖關節脫位患者原代培養成骨細胞和成纖維細胞為對照，研究第二代雙磷酸鹽帕米磷酸鈉對成骨不全患者成骨細胞和成纖維細胞增殖分化功能的影響，探討其在成骨不全癥治療中與臨床治療骨質疏松及骨肉瘤等疾病的異同性，為進一步探討帕米磷酸鈉在成骨不全癥的藥物治療中的作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 帕米磷酸鈉標準品；膠原酶I（sigma）；青鏈霉素、胰蛋白酶、培養液DMEM（Gibco公司）；胎牛血清；地塞米松；Trizol（invitrogen）堿性磷酸酶染色試劑盒（碧云天）；ALP活性檢測ELISA試劑盒；MTT（QIAGEN公司）；倒置顯微鏡；酶免疫檢測儀；CO2培養箱；

1.2 實驗方法 1.2.1 細胞分離與培養 經山東省醫學科學院倫理委員會批準以及受試者知情同意，術中取成骨不全患者和髖關節脫位患者股骨松質骨和大腿皮膚組織，分別至于含20ml無血清DMEM培養液（含10%青鏈霉素）。無菌條件下，取組織置于直徑6cm一次性培養皿中，PBS清洗兩遍除凈血液，清除骨膜、血管及骨縫等結締組織，剪碎骨組織至1mm×1mm大小, PBS液充分沖洗。膠原酶I 37℃消化5h， 離心去上清, 沉淀的細胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養液, 吹打成細胞懸液，置于25cm2 培養瓶中在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養箱中培養。采用第三代成骨細胞和成纖維細胞。

1.2.2 成骨細胞鑒定 取原代培養的第三代成骨不全患者和髖關節患者成骨細胞，細胞長滿約85%時傾去培養液，PBS清洗兩遍，95%乙醇固定10min，堿性磷酸酶染色試劑盒染色液37℃避光孵育15min，傾去染色液PBS清洗兩遍，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 藥物配制及分組 帕米磷酸鈉粉末用PBS溶解，0.1N NaOH調整PH值至7.4，過濾除菌，儲備液濃度為10-2M。取儲備液逐級稀釋至實驗所需藥物濃度10-3M-10-10M。設地塞米松濃度為10-9M為陽性對照。

取三例原代培養的成骨不全患者成骨細胞和成纖維細胞為實驗組，以三例原代培養的髖關節脫位患者成骨細胞和成纖維細胞為正常對照組。

1.2.4 細胞增殖測定(MTT法) 取傳代至3代得實驗組和正常對照組成骨細胞和成纖維細胞以2x103/孔的密度鋪板于96孔板中。每孔加含10%胎牛血清的DMEM培養液200ul，細胞過夜貼壁后更換含藥培養基，陽性對照組換地塞米松培養基，對照組換普通培養基，每個濃度4個復孔，于加藥后48h和72h進行MTT檢測，每孔加入20μ lMTT(5mg/ml)，37℃孵育15min和30min后在酶免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)，波長490nm，取其均值，計算細胞增殖率。以藥物濃度為橫軸，細胞增殖率為縱坐標繪制折線圖。

1.2.5 堿性磷酸酶活性測定 實驗組和正常對照組成骨細胞和成纖維細胞以1x104/孔的密度鋪板于24孔板中，每組每例樣本兩種細胞各鋪一板。細胞過夜貼壁后更換相應藥物培養基，每個濃度2個復孔，加藥后72h收集細胞培養上清液凍存與-20℃，貼壁細胞用PBS清洗2遍，加80ul Trizol充分裂解細胞收集裂解液。實驗組和正常對照組成骨細胞和成纖維細胞每個復孔各取20ul細胞裂解液用于ELISA檢測，酶免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)，波長450nm，取其均值，通過標準曲線計算ALP活性值，以藥物濃度為橫坐標軸，ALP活性值為縱坐標繪制ALP活性變化折線圖。

1.2.6 統計學分析 各組數據應用SPSS12.0軟件處理,應用方差分析以及Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態及鑒定 成纖維細胞剛貼壁時呈長梭形或多邊形（圖1），細胞貼壁后7-10天長滿（圖2），10-14天細胞成簇狀集落生長（圖3）。成骨細胞貼壁后呈短梭形、三角形或多邊形。堿性磷酸酶染色后大部分細胞被染成暗紅色（圖4），成纖維細胞堿性磷酸酶染色后，只有很少量細胞被染成淡紅色（圖5）。

2.2 細胞增殖檢測 藥物作用48h后，細胞增殖差異多數不顯著（P>0.05）,72h時各濃度間差異顯著（表1），顯著性P<0.01。

當藥物濃度為10-3M，10-4M時，均抑制實驗組和對照組兩種細胞的增殖。成骨不全成纖維細胞最佳增殖濃度為10-6M，成骨細胞最佳增殖濃度為10-8M。對照組成纖維和成骨細胞最佳增殖濃度分別為10-5M和10-7M。72h時各細胞增殖率對應藥物濃度變化曲線見表2，表3。

表1 不同濃度藥物處理對細胞增殖率的影響（±s，n=3）

表1 不同濃度藥物處理對細胞增殖率的影響（±s，n=3）

濃度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松實驗組FB (-14.4±1.3)% (-9.7±1.2)% (25.7±0.4)% (37.7±1.2)% (18.9±1.9)% (16.0±0.9)% (10.8±1.5)% (0.2±0.03)% (11.4±0.9)%實驗組OB (-20.4±0.4)% (-12.1±1.4)% (12.9±0.9)% (20.8±0.3)% (34.5±0.7)% (42.8±0.4)% (14.6±0.6)% (13.9±0.5)% (13.8±0.3)%對照組FB (-11.5±0.2)% (-8.4±0.6)% (27.1±0.7)% (18.2±0.7)% (13.8±0.5)% (7.7±0.4)% (4.3±0.1)% (0.17±0.01)% (5.6±0.3)%對照組OB (-13.1±0.4)% (-4.7±0.4)% (13.7±0.7)% (22.5±0.4)% (36.7±0.4)% (32.4±0.5)% (16.4±0.3)% (15.7±0.7)% (11.8±0.5)%

表2 藥物作用72h實驗組與對照組成纖維細胞不同濃度下增殖率比較

表3 藥物作用72h實驗組與對照組成骨細胞不同濃度下增殖率比較

表4 不同濃度藥物處理72h對細胞ALP活性的影響（ALP濃度U/L ±s，n=3）

表4 不同濃度藥物處理72h對細胞ALP活性的影響（ALP濃度U/L ±s，n=3）

濃度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松 對照實驗組FB 9.2±0.1 12.8±0.2 26.0±0.1 35.6±0.2 24.9±0.4 23.9±0.2 20.3±0.2 18.2±0.2 31.1±0.4 17.4±0.3實驗組OB 24.2±0.4 30.2±0.6 65.3±0.8 72.4±0.5 95.0±0.8 101.9±0.6 66.8±0.9 60.7±0.5 84.6±0.3 38.6±0.4對照組FB 11.9±0.2 15.6±0.3 34.6±0.3 28.8±0.6 25.1±0.7 22.9±0.2 18.8±0.2 16.1±0.2 31.3±0.1 17.8±0.2對照組OB 31.4±0.4 39.9±0.3 56.9±0.7 60.5±0.5 100.5±0.7 88.6±0.5 58.3±0.2 56.8±0.3 77.6±0.7 50.1±0.1

表5 藥物作用72h實驗組與對照組成纖維細胞不同濃度下ALP活性比較

表6 藥物作用72h實驗組與對照組成骨細胞不同濃度下ALP活性比較

2.3 細胞ALP活性檢測 兩組樣本兩種細胞經藥物處理后，在一定濃度范圍內細胞ALP活性均增強（表4）。

其中實驗組成骨細胞、成纖維細胞ALP活性最高值對應藥物濃度分別為10-8M和10-6M，而對照組兩種細胞ALP活性最高值對應藥物濃度分別為10-7M和10-5M。以上兩組樣本兩種細胞ALP活性變化趨勢與細胞增殖趨勢相對應，且各濃度間在藥物作用72h時差異顯著,顯著性P<0.01。各組細胞ALP活性比較見表5、表6。

3 討 論

雙磷酸鹽類藥物可降低骨轉換，抑制骨吸收，臨床上常被用于治療一些骨吸收亢進疾病，如絕經后骨質疏松癥、Puget’s病等。以往對雙磷酸鹽的研究主要對破骨細胞的影響其對破骨細胞的影響機制主要是通過抑制破骨細胞內甲羥戊酸通路的關鍵酶使胞內的小G蛋白無法異戊二烯化，從而影響破骨細胞的生長和分化，促其凋亡[2]。近幾年的研究發現雙磷酸鹽可通過成骨細胞間接抑制破骨細胞[3,4]。Igarashi[5]等發現3種不同的二磷酸鹽在成骨樣細胞株MC3T3-E1中抑制內生性前列腺素E2的產生,增強ALP的表達和礦化作用。Giuliani等[6]發現在鼠和人骨髓體外培養中, 二磷酸鹽刺激成骨細胞前體細胞和礦化小瘤的形成。目前，針對雙磷酸鹽對成纖維細胞的作用機制探討主要集中對雙磷酸鹽引起的頜骨壞死疾病（BRONJ）的探討中，研究者發現采用不同劑量的唑來膦酸處理成纖維細胞，其中高于10 μM濃度的唑來磷酸鹽即可引起成纖維細胞的程序性死亡，這種死亡機制部分是由胞內的甲羥戊酸途徑介導的，而較低劑量的唑來磷酸鹽則促進細胞增殖及IL-6，IL-8等細胞因子的表達[7]。Giuliani等[8]等發現雙磷酸鹽類藥物促進集落生長的間充質干細胞表達成纖維細胞生長因子。同時有研究發現，采用三種含氮的雙磷酸鹽（伊班磷酸鹽、帕米磷酸鹽、唑來磷酸鹽）處理人成骨細胞、成纖維細胞和臍靜脈內皮細胞，低劑量的藥物可促進細胞活力和遷移能力[9]。成骨不全癥是由膠原合成相關基因突變導致的骨脆性增加，骨量丟失的遺傳性疾病，病人臨床體征呈現骨質疏松、肌無力、皮膚松弛等相關癥狀。從臨床對成骨不全術后應用雙磷酸鹽藥物治療x光片顯示，患者干骺端骨骨密度增高，說明該藥物有利于患者骨質增強，同時，由于患者膠原蛋白的缺失引起的皮膚松弛，疤痕體質明顯等癥狀在適當計量的雙磷酸鹽作用下也會有一定改善。

目前 ,對于雙磷酸鹽在體內的濃度變化很難做到有效的動態監測。有報道患者靜注帕米磷酸鈉后血液中的濃度可一過性達到10-5M[10],而在局部的骨吸收區域濃度更可高達10-3M[11]。本實驗選用不同濃度梯度（10-3M～10-10M）的帕米磷酸鈉作用于成骨不全癥患者原代培養的成骨細胞和成纖維細胞，并以髖關節脫位患者成骨細胞和成纖維細胞為對照，研究結果顯示，帕米磷酸鈉對細胞的毒性作用在濃度≥10-4M時出現，實驗組兩種細胞最佳增殖濃度均比對照組兩種細胞低十倍，而且實驗組兩種細胞增殖率均大于對照組，即實驗組明顯的表現出對藥物劑量的敏感性高于對照組細胞。

ALP是骨形成所必需的酶,是識別和評價成骨細胞分化程度的早期指標,其活性反映成骨細胞的活性。ALP可催化分解有機磷酸釋放無機磷，增加局部無機磷酸的濃度是啟動礦化的必備條件。本實驗發現在促進細胞增殖的藥物濃度范圍內，細胞ALP活性也有相應的提高，且ALP活性最高值也對應出現在細胞最佳增殖濃度。這說明一定劑量的帕米磷酸鈉可以促進患者細胞堿性磷酸酶的表達，有利于患者成骨細胞和成纖維細胞的分化。

綜上所述，一定劑量濃度的帕米磷酸鈉可以促進患者成骨細胞和成纖維細胞的增殖并增強細胞ALP活性。但是，雙磷酸鹽類藥物針對成骨細胞的活性調節機制尚不明確，而且體外細胞試驗結果只能給臨床該藥物的給藥劑量及給藥途徑提供一定的理論支持。真正意義上的兩者結合還需要進一步的動物實驗來解決。

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