重要深部真菌病研究進展

廖萬清，潘搏，潘煒華

上海長征醫院皮膚病與真菌病研究所/上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室/全軍真菌與真菌病重點實驗室/第二軍醫大學附屬長征醫院皮膚科，上海 200003

真菌廣泛分布于自然界，約有150萬種，其中絕大多數種群對人類直接或間接有利，但有400余種可引起人類疾病。真菌病是由病原真菌引起的人類感染性疾病。真菌感染外可累及皮膚、毛發和指(趾)甲，內可在多臟器播散，免疫抑制患者和無基礎疾病的宿主均可成為真菌宿主。按感染部位可將真菌病分為淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病可累及表皮、毛發和指(趾)甲，深部真菌病指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜和內臟器官所引起的真菌感染性疾病。近年來，隨著免疫抑制劑、皮質類固醇激素和廣譜抗生素在臨床的廣泛應用，以及惡性腫瘤、艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者的增加，深部真菌感染發病率急劇上升。深部真菌病有病情進展快、診斷難、療效差、治療費用高等特點。但目前對病原真菌的研究遠不及細菌、病毒深入，尚需廣大科研和臨床工作者對醫學真菌進一步研究。本文僅就重要深部真菌病的流行病學、真菌與宿主間的相互作用及真菌病的診治作一述評。

1 重要深部真菌病的流行病學

近20年來深部真菌感染呈上升趨勢，已成為威脅人類健康的重要感染性疾病之一。最常引起深部真菌病的真菌包括假絲酵母(又稱念珠菌)、隱球菌和曲霉。此外，接合菌綱、暗色真菌、鐮刀菌屬的某些菌種也可造成深部真菌感染[1]。

侵襲性真菌病中最常見的致病真菌為假絲酵母屬。1995～2002年美國49所醫院連續7年監測資料表明，假絲酵母敗血癥在醫院感染敗血癥中居第4位，病死率則居首位[2]。目前，引起深部感染的假絲酵母主要包括白假絲酵母、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母和克柔假絲酵母，其中白假絲酵母雖占首位，但所占比例逐年下降，非白假絲酵母引起的深部假絲酵母病正逐年上升[3]。

侵襲性曲霉病患者的發病率僅次于假絲酵母敗血癥。引起該病的曲霉主要包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉[4]。骨髓移植、血液惡性腫瘤、實體器官移植、AIDS和肺部基礎疾病患者為該病的易感人群。由于此類患者往往存在基礎疾病，一旦合并曲霉感染，預后嚴重，抗真菌治療失敗率為36%，僅用兩性霉素B治療時病死率高達65%[5]。

隱球菌病主要是由新生隱球菌及格特隱球菌引起的一種深部真菌病，在臨床并不少見。該菌可從鴿糞、土壤及桉樹中分離到。隱球菌病可侵犯皮膚和內臟器官。美國疾病預防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)調查顯示，全球每年因AIDS而新發的隱球菌病病例約1 000 000例，每年約625 000例AIDS患者因該病而死亡。在撒哈拉以南非洲感染性疾病死亡原因中，該病排行第4位[6]。

目前導致人類疾病的隱球菌主要有新生隱球菌和格特隱球菌。其中，格特隱球菌最近從新生隱球菌格特變種水平上升至種的水平，稱格特隱球菌[7]。該菌是造成加拿大溫哥華島隱球菌病流行的主要元兇。以往認為隱球菌為條件致病菌，只在人體免疫功能低下時才引起人類感染。然而最新研究顯示，該病亦可感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)陰性且免疫功能正常的人群，而且與HIV感染或免疫抑制患者相比，這類患者預后往往更差[8]。加拿大暴發的格特隱球菌病累及的也大部分是免疫力正常人群[9]。對從上述北美隱球菌病流行區臨床、環境中分離的隱球菌進行多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，共分離出4種不同基因型格特隱球菌，即VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ，其中VGⅡ型又可分為VGⅡa、VGⅡb和VGⅡc 3種不同亞型。VGⅡa型格特隱球菌在臨床和環境樣本中占主導地位[10]。小鼠動物模型實驗顯示，VG Ⅱ a型表現出更強的致病力[11]。廖萬清等于1980年在國內首次發現格特隱球菌(S8012)屬VG Ⅰ 型，菌株已被美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Center，ATCC)、比利時微生物協作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms，BCCM)、荷蘭微生物菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)等真菌中心永久收錄和保存，并向全球科研機構有償供應(275美元/株)。2008年，姚志榮等在國內發現格特隱球菌VGⅡ基因型。本所陳敏等應用DNA指紋分析技術對從我國東南26個城市108例隱球菌腦膜炎患者體內分離的109株隱球菌進行分子流行病學研究。結果顯示，從HIV陽性患者體內分離的20株隱球菌臨床分離株中，18株(90%)為新生隱球菌格魯比變種(15株基因型為VNⅠ型、3株為VNⅡ型)，另外2株(10%)則為新生隱球菌新生變種(基因型VNⅢ型)。從HIV陰性患者體內分離的89株隱球菌中，76株(85%)為新生隱球菌格魯比變種(64株基因型為VNⅠ型、12株為VNⅡ型)、12株(14%)為格特隱球菌(11株基因型為VGⅠ型、1株為VGⅡ型)，只有1株(1%)是新生隱球菌新生變種(基因型為VNⅢ型)。在所有109株臨床分離株中，106株為α交配型，2株為α/-交配型，1株為α/a交配型[12]。

2 真菌與宿主的相互作用

與一般微生物致病過程一樣，病原真菌的致病也是病原真菌與感染個體相互作用、相互影響的過程。宿主通過多種防御機制抵御真菌侵襲，真菌通過多種毒力因子突破或利用宿主的這種防御功能從而致病。

宿主抵御真菌侵襲的保護機制有特異和非特異之分。非特異保護包括皮膚、黏膜對真菌的機械性阻礙、腸道正常菌群與病原真菌的競爭作用以及由中性粒細胞和巨噬細胞等介導的炎癥反應。特異性免疫主要包括細胞免疫和體液免疫[13,14]。真菌被免疫系統識別并形成肉芽腫在抑制真菌感染播散的過程中發揮重要作用，該過程有多種細胞因子和免疫細胞參與[15]。而致病真菌在漫長的進化歷程中產生多種毒力因子，適于在宿主體內生存。

在對新生隱球菌和格特隱球菌的研究中發現，隱球菌致病與其毒性因子有關。公認的致病隱球菌經典毒力因子包括菌體外莢膜、黑素、37 ℃中的良好生存、巨噬細胞內生長、胞外分泌磷脂酶B和尿素酶等[16]。墨汁染色在鏡下可見隱球菌的厚壁莢膜，該特殊結構能幫助其抵制巨噬細胞的吞噬作用。如果被吞噬，大多數隱球菌可被巨噬細胞消滅；但當宿主免疫力降低時，隱球菌即使被吞噬，也能在細胞內生存，而能在巨噬細胞內生存是隱球菌向全身播散的重要原因。最近研究顯示，含隱球菌的巨噬細胞通過血-腦屏障是隱球菌進入腦脊液造成隱球菌腦膜炎的主要途徑，即“特洛伊木馬”途徑(Trojan horse strategy)[17]；隱球菌生產黑素可發揮抗吞噬細胞氧化殺菌作用、降低抗真菌藥物敏感性、干擾抗體介導的吞噬作用和保護菌體在極端溫度下生存。最新研究表明，隱球菌產生的尿素酶和磷脂酶與其在巨噬細胞內生存有直接聯系[18]；而在37 ℃中生存則是該菌使人類致病的必要條件，與其他非致病真菌相比，隱球菌表現出更強的耐熱性。這些毒力因子在隱球菌適應和逃避宿主免疫功能方面發揮重要作用。

通過基因敲除和比較基因組學分析確定了一些與上述隱球菌毒力因子有關的基因(如莢膜形成相關的GPA1、CAC1、STE12等，黑素生成相關的CAC1、PKA1等，37 ℃中生長相關的CNA1、CNB1、RAS1等，細胞內生存相關的PLB1、SOD1等)；并且發現新生隱球菌不同變種的關鍵毒力因子基因并不相同，如STE12是隱球菌新生變種的關鍵致病基因，而格魯比變種的關鍵致病基因為STE20[19]。對隱球菌交配型的研究發現，α型新生隱球菌有更強的致病能力，這種致病能力受隱球菌MAT位點中的CPR基因控制[20]。但是這些毒力相關基因具體表達何種分子，又通過何種途徑使隱球菌能逃避宿主免疫細胞的殺傷，有待深入研究。

另外，致病真菌的形態學變化也貫穿于真菌與宿主相互作用過程中。如白假絲酵母在感染宿主時產生芽生酵母(假菌絲)和菌絲，假菌絲狀態可產生芽管特異抗原，增強該菌的黏附性。并且當宿主免疫力低下時，白假絲酵母被巨噬細胞吞噬后仍能在胞內產生菌絲，從而穿透、破壞巨噬細胞發揮更強的致病力。在感染過程中，形成菌絲的其他病原真菌還包括曲霉和接合菌的某些菌種。組織胞漿菌和皮炎芽生菌則表現出溫度介導的雙相性，在自然環境中以菌絲形態存在，而在宿主37 ℃環境中形成酵母樣結構。有理由相信，這種形態學改變在真菌的致病過程中發揮至關重要的作用。與這些形態學變化有關的真菌信號通路有待進一步研究。

因此，隨著研究深入，病原真菌與宿主相互作用過程已有所揭示，但仍存在較多的研究空白，有待繼續發掘。明確病原真菌與宿主免疫系統相互作用過程，探討其如何逃避宿主免疫細胞的殺傷及干擾宿主免疫功能對疾病診治有重大意義，這正是推動侵襲性真菌臨床預防和診治研究的關鍵。

3 重要深部真菌病的診斷現況和進展

由于深部真菌病的癥狀、體征缺乏特異性，多有基礎疾病掩蓋，且不如細菌感染那樣被臨床醫師熟知，所以經常造成漏診、誤診。如侵襲性肺曲霉病經常被誤診為肺部細菌感染，肺隱球菌病被誤診為肺癌，隱球菌腦膜炎被誤診為病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎。深部真菌病的診斷對臨床醫師和檢驗技師均是富有挑戰的工作。目前，直接鏡檢、培養和組織病理學檢查仍是深部真菌病診斷的“金標準”，但這些傳統檢驗方法存在經驗要求高、主觀判斷性強等缺點。影像學診斷作為輔助檢查的重要手段可提示某些真菌病﹝如肺部高分辨計算機斷層掃描(computed tomography，CT)出現“暈輪征”和“新月征”提示肺曲霉病﹞，但這種診斷方法缺乏敏感性和特異性。

基于真菌代謝產物分析的檢測方法主要有API法和產色培養基鑒定法，前者通過觀察真菌對鑒定板上不同培養基的同化情況，結合真菌菌落形態學特點鑒定菌種。產色培養基如科瑪嘉假絲酵母顯色培養基可對常見的致病假絲酵母進行鑒別，方便、直觀，基本可滿足臨床假絲酵母鑒定的需要。但這種方法僅能對假絲酵母進行檢測，鑒定能力有限，無法鑒別其他致病真菌。

隨著對真菌研究的深入，真菌病的血清學診斷、基于真菌抗原檢測的快速診斷以及鑒定真菌菌種的檢驗法已在臨床得到廣泛應用。

血清學診斷法主要包括抗原和抗體檢測。隱球菌乳膠凝集試驗以高效價抗隱球菌莢膜多糖抗體包被乳膠顆粒，檢測血清或腦脊液標本中的隱球菌莢膜多糖抗原。曲霉半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)試驗則是用雙夾心酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測標本中的曲霉GM抗原，但患者感染馬爾尼菲青霉時會出現假陽性結果，且對檢測閾值的判斷存在爭議。隱球菌乳膠凝集試驗和曲霉GM試驗有較高的敏感度和特異度，且能半定量分析抗原，從而反映疾病進展情況。β-1,3-D-葡聚糖存在于除接合菌和隱球菌之外的真菌細胞壁中，其他微生物、哺乳動物體內不含此成分。20世紀90年代就有學者將其用于深部真菌感染的診斷，即G試驗。但該法假陽性與假陰性報道屢見不鮮，甚至呼吸道定植的真菌亦可出現陽性結果[21]。

上述這些方法雖然能方便、快捷地鑒定真菌，但仍不能對真菌的亞型進行鑒別，且不能定量反映體內真菌含量。分子生物學技術的飛速發展，為深部真菌病的診斷帶來了曙光。這種基于核酸分子雜交和核酸分子擴增的檢測方法，對微生物的保守靶基因進行檢測，從而保證檢測的特異性。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)相關分子生物學診斷方法現已用于臨床乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的定量分析，有快速、靈敏、準確、所需樣本量少等優點。分子生物學診斷方法在真菌病診斷方面有很大的發展空間，國外已用于臨床培養標本和組織病理切片的雙相真菌鑒定，商品化的莢膜組織胞漿菌、球孢子菌以及皮炎芽生菌DNA探針也已獲美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準上市并廣泛使用[22]。

活檢組織、血液、肺泡灌洗液、腦脊液及培養分離的菌株均可作為分子生物學診斷的樣本。PCR相關分子生物學診斷技術，如實時熒光定量PCR、套式PCR和多重PCR，是目前研究最多的檢測方法。這些技術主要以真菌的rRNA基因及其中的內轉錄間隔區(internal transcribed space, ITS)為模板，設計引物進行檢測。有學者應用套式實時熒光定量PCR對患者全血樣本進行檢測，發現對侵襲性曲霉病確診和擬診患者的檢測敏感度達92.3%，特異度達94.6%[23]。該法還可用于真菌耐藥基因檢測，從而指導臨床用藥。曲霉對三唑類抗真菌藥的耐藥機制與編碼胞膜上藥物結合靶點羊毛固醇14α-脫甲基酶基因改變有關，有學者成功應用實時熒光定量PCR對耐藥煙曲霉株的該突變基因進行了檢測[24]。

其他分子生物學診斷方法還包括DNA指紋技術，其中限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)指紋分析法、微衛星長度多態性(microsatellite length polymorphism，MLP)和MLST可較可靠地對不同曲霉進行鑒定[25]，在真菌分子流行病學研究中有廣闊用途。而DNA微陣列檢測技術(microarry)因其所需樣本少、高通量、自動化檢測等優點，目前已用于真菌的毒力基因篩選。有學者將該法用于臨床樣本檢測，也獲得較好的敏感度[26]。核酸序列擴增法(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)是由1對特異引物識別、3種酶催化、以單鏈RNA為模板的恒溫擴展技術，擴增效率高，目前已廣泛用于多種DNA和RNA病毒的診斷，敏感度高，并已嘗試用于真菌鑒定。

立足并不斷改良傳統診斷方法，結合血清學方法、影像學檢查，是提高目前深部真菌病診斷水平的最佳途徑；在此基礎上開發的新型分子生物學檢測方法由于價格昂貴、操作繁瑣、缺乏標準，使用受到限制，現僅用于罕見、少見真菌感染的診斷，為臨床提供了一種新的診斷方法。

4 抗真菌藥物與真菌耐藥

抗真菌藥物的研發遠落后于抗細菌藥物的研發，臨床可供選擇的藥物很少。如兩性霉素B是一種古老的抗真菌藥，對肝、腎毒性大，很多患者不能耐受，但因其抗真菌譜廣、抗真菌活性強，現仍為許多深部真菌病的一線用藥。

為適應臨床需要，抗深部真菌藥逐漸向低毒、廣譜、高效的方向發展，主要成就體現在新型抗真菌藥物的研制和新型藥物載體的開發。近年來一些安全性較高的新型抗真菌藥物如三唑類、棘白球素類藥物用于臨床，但受抗真菌活性及價格等因素限制，仍無法取代兩性霉素B在臨床的地位。在這種情況下，兩性霉素B改良劑型——兩性霉素B脂質體應運而生，雖可降低不良反應，但存在治療劑量不穩定、毒性不明確，且價格昂貴等缺點。

常見的抗真菌藥物根據作用機制不同分為：①作用于真菌細胞膜，如干擾麥角固醇合成(三唑類、丙烯胺類和嗎啉類)、損害胞膜脂質結構及其功能(多烯類)；②影響真菌細胞壁合成(棘白菌素類)；③干擾真菌核酸合成(5-氟胞嘧啶)；④其他(碘化鉀和在研的某些針對蛋白質翻譯過程的新藥)。

三唑類藥物是近年來發展最快的抗真菌藥。與第1代三唑類藥物氟康唑和伊曲康唑相比，第2代三唑類抗真菌藥伏立康唑、泊沙康唑和雷夫康唑(ravuconzazole)的抗真菌譜更廣。伏立康唑對耐氟康唑的光滑假絲酵母和克柔假絲酵母仍有抗真菌活性，美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)已將伏立康唑作為侵襲性曲霉病的一線用藥[27]。泊沙康唑對接合菌也有較好的抗真菌作用，是現有抗真菌藥物中除兩性霉素B外對接合菌效果較好的藥物。該藥目前已在歐美上市，我國尚在審批中。

降低藥物毒副作用的一條途徑就是使藥物僅針對微生物的特有結構。如β-內酰胺類抗生素是臨床最為熟知的抗生素，以有效性和安全性而著稱。究其原因就是它具有獨特的作用靶點——細菌細胞壁的黏肽合成酶，即青霉素結合蛋白。因為人類細胞不含有細胞壁，所以該藥針對性強，對人體的毒性小。雖然真菌也屬于真核細胞，但與哺乳動物的細胞不同，真菌有細胞壁，主要成分為β-葡聚糖、幾丁質和甘露聚糖蛋白復合物，它對維持真菌生長和正常生理功能有重要作用。針對這些成分的藥物由于其高選擇性及較強的抗真菌活性，是近年來抗真菌藥物研究的一大熱點。2001年在美國上市的第1種棘白菌素藥物——卡泊芬凈的作用機制就是抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶。IDSA 在2009年更新的假絲酵母病治療指南中將該藥作為假絲酵母血癥和食管假絲酵母病的一線用藥，并對非白假絲酵母感染患者推薦使用[28]。另外2種棘白菌素藥物——米卡芬凈和阿尼芬凈也分別于2005年和2006年獲FDA批準上市。這3種藥物中，阿尼芬凈的半減期最長，達24 h，而且代謝過程不同于其他棘白菌素類抗真菌藥。它在體內以化學降解方式清除，降解產物經膽汁由糞便排泄，適用于肝、腎功能不全患者。但棘白菌素類抗真菌藥僅對假絲酵母和曲霉感染有效，對隱球菌、毛孢子菌、接合菌、鐮刀菌感染無效。由于生物利用度的問題，該類藥物均為靜脈劑型，尚無口服制劑。

與細菌一樣，真菌也存在對抗真菌藥耐藥性的問題。真菌耐藥分為天然耐藥(intrinsic)和獲得性耐藥(acquired)。如克柔假絲酵母、光滑假絲酵母和多數絲狀真菌對氟康唑天然耐藥，土曲霉對兩性霉素B天然耐藥，接合菌對多數抗真菌藥物天然耐藥。獲得性耐藥可能是致病真菌在抗真菌藥物存在時迫于環境壓力“優勝劣汰”所致，此時抗真菌藥作用的真菌靶點相關基因多發生暫時或永久突變。如白假絲酵母對唑類藥物獲得性耐藥的3個主要機制是藥物外排泵基因(CDR1、CDR2等)激活、藥物結合位點(編碼羊毛固醇14α-脫甲基酶基因ERG11)突變或過度表達和導致麥角固醇合成減少的相關基因(ERG3)突變[29]。

測定抗真菌藥物對病原真菌的抑制活性可采用體外藥敏試驗，但往往不能真實反映體內真菌對藥物的敏感程度。這是因為真菌感染宿主是一個復雜的動態過程，眾多的免疫細胞和炎性因子參與其中。體外試驗無法完全模擬真菌在體內的生存狀態，而且藥代動力學、感染部位(如腦脊液、心臟瓣膜、眼和前列腺等特殊部位感染)的不同及真菌生物膜的形成都可能影響抗真菌藥物的療效。因此，臨床抗真菌治療失敗的原因很多，真菌耐藥可能只是原因之一，還需要從患者免疫狀態、感染部位、藥物生物利用度和藥物代謝速度等多方面考慮。

5 結語

隨著新技術、新方法的出現，人們對深部真菌病的流行病學、毒力因子等認識不斷深入，對深部真菌病的診治技術也有很大提高，但仍存在許多亟待解決的問題，如我國缺乏深部真菌病多中心流行病學調查、自動化臨床真菌檢測分析設備、分子生物學真菌診斷技術臨床應用及新型抗真菌藥物(包含新劑型)和疫苗的研制。解決這些問題將對臨床深部真菌病的診治和預防、抗真菌藥物自主專利的研發有重要意義，可產生極大的社會和經濟效益。

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