泡沫細胞寡核苷酸適配子PM2的特異性研究

林廣慶 嚴鵬科▲ 汪江波 張 慧 段才聞 李世煌

（1.廣州醫學院附屬第三醫院藥劑科，廣東廣州510150；2.廣西壯族自治區南溪山醫院藥劑科，廣西桂林541002；3.南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽421001）

泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變的特征性病理細胞，其中巨噬細胞源性的泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變中最早出現、最主要的泡沫細胞。Andrew等在Nature Medicine上專文指出，巨噬細胞源性的泡沫細胞有可能成為動脈粥樣硬化診斷和治療的靶點[1]。

SELEX技術是20世紀90年代創立的一種的生物文庫技術[2-3]。利用該技術可以從一個大容量的隨機寡核苷酸文庫中篩選得到與靶物質高特異結合親和的配基即適配子。它是一個DNA或RNA的寡核苷酸片段，具有靶向靶物質及抑制靶蛋白功能的作用，因此，在基礎研究、藥物篩選及臨床診斷和治療等方面有著廣闊的應用前景。

筆者利用SELEX技術篩選出了巨噬細胞源性泡沫細胞的36個適配子，本研究就其中的40號適配子命名為PM2對動脈粥樣硬化病變組織結合的特異性作了進一步研究，現將研究結果進行報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

THP-1細胞株、內皮細胞株為南華大學心血管研究所所保存；血管平滑肌細胞由SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞培養而得；新生牛血清購自杭州四季清生物工程材料有限公司；佛波酯（PMA）為CALBIOCHEM公司產品；低密度脂蛋白（LDL）由北京老年病研究所提供；新西蘭白兔：雄性，由湖南農業大學動物科技學院實驗動物中心提供，合格證號為scxk（湘）：2003-0003。

1.2 適配子的合成

FITC標記的PM2適配子由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 細胞培養

THP-1細胞株培養：用含有10%新生牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。每2～3天用直接分瓶的方法傳代。

內皮細胞株培養：用含有15%新生牛血清的高糖DMEM培養基于37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。每2～3天用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

大鼠血管平滑肌細胞培養：在無菌條件下將體重150～200g、4～8周齡的SD大鼠的胸主動脈段取出，刮除內膜迅速撕下中膜內、中層，切成約1mm寬的小條，種植于培養瓶壁，置于37℃恒溫箱，待細胞鋪滿瓶底后進行細胞傳代。

1.4 泡沫細胞模型的建立

THP-1細胞培養于6孔板中，實驗前用100nmol/L PMA孵育72h，使其誘導分化成巨噬細胞，再用80mg/L oxLDL孵育72h，誘導成泡沫細胞。

1.5 適配子與巨噬細胞源性泡沫細胞結合的特異性鑒定

將培養于6孔板內的約1×106THP-1巨噬細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞及巨噬細胞源性泡沫細胞分別用37℃PBS洗滌3次，分別加入含200pmol FITC標記適配子和1μg酵母tRNA的37℃DPBS液37℃溫箱孵育30min,去掉上清液后，再用37℃PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.6 動脈粥樣硬化動物模型的建立

新西蘭兔10只，雄性，體重約2.0～2.3kg，隨機分為兩組，每組各5只。對照組：普通全價營養飼料（粗蛋白20%，粗脂肪13%，碳水化合物60%，灰分1%，維生素混合物1%）；高脂組：在普通全價營養飼料基礎上添加1%膽固醇和10%豬油。12周后處死動物，將主動脈自升主動脈至髂總動脈分叉處取出后，福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋后，用Leitz 1560切片機連續切片。

1.7 適配子與動脈粥樣硬化病變結合的PCR鑒定

將動脈切片二甲苯常規脫蠟至水，抗原修復后滴入50pmol FITC標記適配子和1μg的酵母tRNA，37℃溫箱孵育30min。去離子和PBS液沖洗后，將動脈切片放入6孔板內并加入900μL洗脫液，放入80℃的恒溫水箱中15min。將孔內的洗脫液吸出均勻地分裝于兩個1.5mL的EP管中，加入1/10體積3mol/L NaAC（PH=5.2）和2倍體積預冷的無水乙醇，振蕩混勻后放入-80℃冰箱3h或過夜。12000rpm離心30min，經70%乙醇洗滌、空氣中干燥后溶于10μL滅菌水中，進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性40s，72℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環。最后，72℃再延伸7min。

1.8 適配子與動脈粥樣硬化病變結合情況的觀察

50pmol FITC標記適配子和1μg 的酵母tRNA滴入經脫蠟和修復抗原處理的動脈切片，37℃溫箱孵育30min后，去離子水和PBS液沖洗后熒光顯微鏡下觀察適配子與動脈粥樣硬化病變的結合情況。

2 結果

2.1 適配子與巨噬細胞源性泡沫細胞結合的特異性鑒定

在熒光顯微鏡觀察FITC標記的適配子與巨噬細胞源性泡沫細胞結合的特異性，結果發現PM2適配子明顯地結合到了巨噬細胞源性泡沫細胞上，泡沫細胞上出現了較強的熒光；與THP-1巨噬細胞存在少量的結合；基本上不結合血管平滑肌細胞和內皮細胞，見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察PM2適配子與巨噬細胞源性泡沫細胞結合的特異性（×200）

圖2 新西蘭兔主動脈HE染色結果（×200）

2.2 動物動脈粥樣硬化模型的建立

新西蘭兔正常組和模型組分別用普通飼料和高脂飼料飼養12周后，放血處死取出主動脈進行蘇丹Ⅳ染色及石蠟包埋、連續切片后HE染色。結果可見動脈粥樣硬化病變，說明動物動脈粥樣硬化模型的建立成功。見圖2。

2.3 適配子與動脈粥樣硬化病變結合的PCR鑒定

為了證實PM2適配子與動脈粥樣硬化病變結合的特異性，筆者將PM2適配子孵育于動脈粥樣硬化兔主動脈病變部位，用洗脫液洗脫后，溶于少量滅菌去離子水中，進行30個循環PCR擴增。通過2.5%的瓊脂糖電泳檢測發現，PM2適配子均能特異性結合于兔主動脈動脈粥樣硬化病變部位；動脈粥樣硬化病變的洗脫回收液經PCR擴增都有目的dsDNA片斷出現，而正常動脈都無任何dsDNA片斷，見圖3。

圖3 聚合酶鏈反應觀察FITC標記的PM2適配子與動脈粥樣硬化病變結合的情況

2.4 適配子與動脈粥樣硬化病變結合的特異性觀察

將動脈粥樣硬化病變切片與PM2適配子結合后，在熒光顯微鏡下觀察發現，動脈粥樣硬化病變處有較多的散在的熒光點，中膜平滑肌上除了靠近斑塊的部分由少量熒光點外，其他部分幾乎沒有熒光點，說明動脈粥樣硬化病變與適配子特異性結合，見圖4。

圖4 熒光顯微鏡觀察PM2適配子與動脈粥樣硬化病變結合的情況（×100）

3 討論

單鏈隨機寡核苷酸分子（包括DNA和RNA分子）容易形成各種形狀的二級結構和三級結構，如莖環、假節、鼓包、G-四聚體等，基本涵蓋所有的空間構像，尤其是RNA分子形成的空間構象更復雜、多樣。包括細胞因子、藥物、蛋白質、氨基酸、有機染料、完整的組織細胞、甚至金屬離子等在內的幾乎任何一個靶物質都可以利用 SELEX技術獲得與之匹配的寡核苷酸適配子。這些適配子與靶物質結合具有極高的親和性和特異性，結合的解離常數多在pmol/L～nmol/L之間，明顯強于其他物質，甚至強于天然配基[4-5]。而且，其特異性和親和性不受組織或樣品中的非靶蛋白的干擾。寡核苷酸適配子還具有很強的分辨能力，能分辨出靶物質上的細微結構，如一個甲基或羥基的區別。核苷酸、氨基酸的適配子能將它們與突變體、D/L鏡象體區分開來。此外，這些適配子基本無毒、無免疫原性、可重復使用、長期保存和室溫運輸。其中DNA適配子相對于RNA適配子生產成本低、SELEX篩選更簡單方便且體內較穩定，不易被降解，更適合體外診斷和體內治療。

從功能上來說，寡核苷酸適配子能特異性地與靶蛋白結合，并阻斷或封閉靶蛋白的功能，對傳染病、炎癥性疾病等疾病的治療的研究開辟了新的思路。如通過SELEX篩選獲得的HIV-1逆轉錄酶的適配子[6]、流感病毒凝血酶的適配子[7]分別可以顯著抑制HIV病毒和流感病毒復制，降低傳染性。寡核苷酸適配子還可以用作靶向劑。由于體積小，有很強的穿透作用且易被血液清除，與放射性同位素、顯影劑、藥物連接后，靶向病變組織，可用于疾病的體內診斷和治療。如99mTC锝標記的中性粒細胞彈性蛋白酶的適配子[8]能特異性地在炎癥區成像；將適配子修飾后，攜帶放療、化療藥物進入腫瘤組織，可以提高腫瘤治療的特異性。

目前臨床確診動脈粥樣硬化的檢查如血管內超聲（IVUS）、動脈造影價格昂貴，操作技術要求高、對患者有創，因此不容易為患者所接受，更不宜用于動脈粥樣硬化高危人群的普查和篩選。尤其是動脈造影，對于早期并不以動脈狹窄為主要表現的動脈粥樣硬化很難作出診斷，因而限制了其臨床應用。而近年的研究顯示[9]，動脈粥樣硬化引起的臨床事件如急性冠脈綜合征的發生往往與動脈粥樣硬化引起的動脈狹窄無明顯的相關性。在治療方面，以他汀類藥物為代表的抗動脈粥樣硬化藥物的出現雖然給動脈粥樣硬化的治療帶來了希望，但靶向作用不佳，長期服用會帶來嚴重的副作用。因此，早期診斷與靶向治療仍然是動脈粥樣硬化的防治的一個“瓶頸”問題。

巨噬細胞源性泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊中最早出現、最主要的標志性細胞，貫穿于整個動脈粥樣硬化發生、發展過程，促進細胞內的膽固醇流出對于動脈粥樣硬化的轉歸有著重要意義[10-11]。巨噬細胞源性泡沫細胞的過度凋亡及脂質的增多導致的脂質核心的不斷擴大會大大增加動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性。有研究表明[12]大多數急性冠脈綜合征患者的動脈斑塊中有大量的巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡，而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡、減少細胞內的脂質將有利于穩定斑塊，促進動脈粥樣硬化的消退。

筆者所在單位以巨噬細胞源性泡沫細胞為靶，利用SELEX技術篩選出寡核苷酸適配子PM2后，結合PCR方法對其與巨噬細胞源性泡沫細胞和動脈粥樣硬化病變結合的特異性進行鑒定,結果發現這個適配子特異性結合巨噬細胞源性泡沫細胞；與動脈粥樣硬化病變結合也有很強的特異性，說明我們已經成功地獲得特異性親和巨噬細胞源性泡沫細胞的適配子，這也許對于開發針對動脈粥樣硬化的早期診斷試劑和靶向治療藥物有著潛在的重要意義。

[1] Li AC，Glass CK.The Macrophage foam cell as a target for herapeteutic Intervention[J]. Nat Med，2002， 8（11）：1235-1242.

[2] Tuerk C，Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment： RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J]. Science，1990，249（4968）：505-510.

[3] Ellington AD，Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature， 1990，346（6287）：818–822.

[4] Soontornworajit B，Wang Y. Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis：cell detection and molecular imaging[J]. Anal Bioanal Chem，2011，399（4）：1591-1599.

[5] Clark SL，Remcho VT. Aptamers as analytical reagents[J].Electrophoresis，2002，23（9）：1335-1340.

[6] Joshi P，Prasad VR. Potent inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by template analog reverse transcriptase inhibitors derived by SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）[J]. J Viral，2002，76（13）：6545-6557.

[7] Sung Ho Jeon，Basak Kayhan，Tamar Ben-Yedidia，et al. A DNA aptamer prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin[J]. The Journal of Biological Chemisty，2004，276（49）：48410-48419.

[8] Charlton J，Sennello J，Smith D. In vivo imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase[J]. Chem Biol,1997，4：809-816.

[9] Folk E，Shah PK. Coronary plaque disruption[J].Circulation，1995，92：657-672.

[10] Igarashi M，Osuga J，Uozaki H，et al. The critical role of neutral cholesterol ester hydrolase 1 in cholesterol removal from human macrophages[J]. Circ Res，2010，107（11）：1387-1395.

[11] Larigauderie G，Furman C. Adipophilin enhance lipid accumulation and prevents lipid efflux from THP -1 Macrophage： potential role in atherogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（3）：504 -510.

[12] Gellisen IC，AJ Brown，EL Mander，et al.Sterol efflux is impaired from foam cells selectively enriched with 7-ketocholesterol[J]. Biol Chem，1996，271（30）：17582-17860.