抗癌藥酒抑瘤及對小鼠免疫功能影響的研究

劉淑杰，蔡 兵，郭 婕

（1.北京懷柔中醫(yī)院，北京 100000；2.北京生物醫(yī)藥研究所，北京 100091；3.北京善緣生門診部，北京 100176）

藥酒即加入中藥的酒，在我國的醫(yī)藥史上是傳統(tǒng)劑型之一，是一個(gè)獨(dú)特的中醫(yī)治療方法[1]。近年來我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)治療癌癥有效的藥酒配方。該藥酒對一些晚期癌癥患者治療效果明顯，能延長癌癥患者的生存期，提高其生活質(zhì)量。因此我們對其抗癌活性對免疫方面的影響進(jìn)行了探討?？拱┧幘剖怯芍兴幎x夏草、 靈芝、西洋參、白花蛇草、半枝蓮、蒲公英、大黃、金銀花、茯苓、甘草、夏枯草、柴胡和大薊組成，用56℃北京紅星二鍋頭白酒按1∶3比例浸泡1個(gè)月后濾去藥渣收集濾液而成。我們利用小鼠轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型，觀察了該藥酒的抗癌效果并對藥酒提高免疫力的能力和安全性進(jìn)行了評價(jià)。

1 資料與方法

1.1 試劑

胎牛血清和RP1640購自美國Gibco公司，羧甲基纖維素鈉（CMC）購自Sigma公司。注射用環(huán)磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。慈丹膠囊，福州梅峰制藥廠生產(chǎn)。藥酒由北京善緣生門診部提供?？鼓[瘤作用的觀察直接使用藥酒，免疫力影響和安全性評價(jià)是將藥酒經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀，制成浸膏，低溫冷凍干燥成的粉末，每毫升藥酒制成濃縮粉20 mg。臨用前以1%CMC制成混懸液。

1.2 儀器

超凈工作臺（美國SGE400）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS SK400）；高壓滅菌鍋(日本YAMATO SM52)；二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO MCQ-175）；電子天平（美國SL3000）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM，C57，Balb/c小鼠，均由北京醫(yī)科院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXR（京）2005-0013。

1.4 瘤株

肝癌（H22）、路易斯肺癌（Lewis’L.C.）由中國醫(yī)科院腫瘤研究所提供。

1.5 方法

1.5.1 抗癌藥酒抗腫瘤作用的觀察

動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn) 將KM小鼠腹水傳代第7～9 d腫瘤制備瘤細(xì)胞液（H22），用無菌生理鹽水按1∶3 比例，配制成癌細(xì)胞懸液，對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行造模。每只鼠右前腋下皮下接種0.2 mL/鼠（4×106C），C57小鼠皮下傳代第8～10 d腫瘤制備瘤細(xì)胞液（Lewis’L.C.），每只鼠右前腋下皮下接種0.2 mL/鼠（5×106C），以上均在無菌環(huán)境中操作[2]。

給藥 取健康小鼠，設(shè)5組，即荷瘤對照組，溶劑對照組，陽性藥對照組（環(huán)磷酰胺或慈丹膠囊）及藥酒2個(gè)劑量組。雌雄各半。每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL癌細(xì)胞懸液，24 h后隨機(jī)分組給藥。對照組給予蒸餾水，溶劑對照組給予20 mL的40°二鍋頭白酒，陽性藥對照組動(dòng)物腹腔注射或灌胃給藥。給藥組給予 10和20 ml/kg藥酒灌胃，每天1 次，連續(xù)給藥10 d。按10 g小鼠質(zhì)量給0.1 ml比例配制藥物。

測腫瘤抑制率 末次給藥后24 h，小鼠斷頸處死，剝離完整腫瘤組織，電子天平稱量瘤體濕質(zhì)量，并計(jì)算腫瘤生長抑制率。抑瘤率（%）=（1-荷瘤給藥組瘤質(zhì)量/荷瘤對照組瘤質(zhì)量）×100%。

1.5.2 抗癌藥酒對小鼠免疫器官的影響 二級BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量20～22 g，隨機(jī)分4組，對照組和三個(gè)給藥組（1 mg，5 mg，10 mg/kg），每組16只。各組每天灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，對照組以1%CMC溶液灌胃。末次給藥1 h后稱其體質(zhì)量，斷頭處死，立即取出脾臟，用精密天平稱重測量臟器系數(shù)濕質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/體重（g）[3]。

1.5.3 抗癌藥酒最大耐受量的評價(jià) 取健康的KM小鼠40只，體質(zhì)量26 g左右，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h不禁水, 灌胃給藥后。小鼠自由攝取餌和水。將樣品配制成4.2 g/mL濃度，1 d間隔4 h 2次灌胃，每次給藥容積是0.8 mL，給藥量為18 g/kg。給藥后連續(xù)觀察14 d。計(jì)算耐受倍數(shù)。小鼠的最大耐受倍數(shù)＝（每只小數(shù)的耐受藥量/小鼠的平均體重）×成人平均體重/成人每日用量[3]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抗癌藥酒抗腫瘤的作用

藥酒對小鼠肝癌體內(nèi)給藥具有明顯療效，口服（10 mL/kg和20 mL/kg，PO×10）抑瘤率分別為43.2%和28.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，10 mL/kg PO×10），對照藥CTX（30 mL/kg，ip×10）抑瘤率為73.0%；證明動(dòng)物模型成功。對小鼠路易斯肺癌，口服藥酒（10 mL/kg和20 mL/kg，PO×10）抑瘤率達(dá)44.26%和32.24%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，10 mL/kg PO×10），對照藥慈丹膠囊（1.5 g/kg，PO×10）抑瘤率為39.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表2。

表1 口服抗癌藥酒對小鼠移植性腫瘤肝癌的作用

表1 口服抗癌藥酒對小鼠移植性腫瘤肝癌的作用

組別 劑量 動(dòng)物數(shù)（n）給藥途經(jīng)×次數(shù)體質(zhì)量 瘤質(zhì)量 抑瘤率（%） P給藥前 給藥后模型組 蒸餾水20 mL/kg 8 PO×10 18.7±0.46 30.7±2.99 3.41±1.72 － －對照組 白酒20 mL/kg 8 PO×10 18.7±0.46 27.8±1.86 3.26±1.15 4.2 ＞0.05 CTX組 30 mg/kg 8 iP×10 18.2±0.86 26.5±2.3 0.92±0.32** 73.0 ＜0.01藥酒組 20 mL/kg 8 PO×10 18.4±0.42 28.2±3.36 2.45±0.75 28.2 ＞0.05藥酒組 10 mL/kg 8 PO×10 18.7±0.41 29.4±2.13 1.94±0.82* 43.2 ＜0.05

表2 抗癌藥酒對小鼠移植性腫瘤路易斯肺癌的作用

表2 抗癌藥酒對小鼠移植性腫瘤路易斯肺癌的作用

組別 劑量 動(dòng)物數(shù)（只）給藥途經(jīng)×次數(shù)瘤質(zhì)量 抑瘤率（%） P給藥前 給藥后體質(zhì)量模型組 蒸餾水20 mL/kg 10 PO×10 19.3±0.97 21.8±1.22 1.83±0.91 － －白酒對照 白酒20 mL/kg 10 PO×10 19.5±1.06 21.9±1.11 1.75±0.20 4.4 ＞0.05慈丹膠囊 1.5 g/kg 10 PO×10 19.1±0.63 21.5±1.21 1.12±0.79* 38.8 ＜0.05藥酒 20 mL/kg 10 PO×10 18.5±1.94 20.18±1.83 1.24±0.60* 32.24 ＜0.05藥酒 10 mL/kg 10 PO×10 19.7±0.64 21.4±1.14 1.02±0.55** 44.26 ＜0.01

2.2 抗癌藥酒對小鼠脾指數(shù)的影響

與對照組比，藥酒的中劑量和高劑量組都能明顯提高小鼠脾指數(shù)，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 藥酒對小鼠免疫活性（脾指數(shù)）的影響

表3 藥酒對小鼠免疫活性（脾指數(shù)）的影響

組別 劑量（mL/kg）動(dòng)物數(shù)（只）給藥途經(jīng)×次數(shù) 瘤質(zhì)量 P溶劑對照組 15 PO×10 3.68±0.33 －低劑量組 1 15 PO×10 3.70±0.25 ＞0.05中劑量組 5 14 PO×10 3.90±0.36* ＜0.05高劑量組 10 15 PO×10 3.90±0.36* ＜0.05

2.3 抗癌藥酒最大耐受量的評價(jià)

限于給藥濃度和給藥體積，1 d內(nèi)給予小鼠的最大量為18 g/kg，14 d內(nèi)小鼠未出現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡，測得該藥物小鼠口服的最大耐受量為18 g/kg。

3 討論

近幾年，我國惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率明顯上升，已成為危害人民健康和生命的主要疾病。惡性腫瘤的化學(xué)治療是腫瘤治療的主要手段之一，但化療藥的毒副作用一直是醫(yī)務(wù)工作者和患者的棘手問題，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。因此開發(fā)有效低毒的中藥抗癌藥是一個(gè)熱點(diǎn)。

酒本身就是一種良好的有機(jī)溶媒，有良好的穿透性，易于進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，可以把中藥里的有效成分高效地提取出來，更好地發(fā)揮出生藥原有的作用。幾年來有很多癌癥患者服用了該藥酒，很大程度地延長了患者生存率，改善了生存質(zhì)量。但其只是一個(gè)驗(yàn)方，尚未做有關(guān)該藥酒的基礎(chǔ)研究。我們對該藥酒的抗癌作用、是否提高免疫力和安全性進(jìn)行了評價(jià)。

通過對小鼠移植性腫瘤的模型觀察，抗癌口服藥酒具有一定的抑瘤作用，對小鼠肝癌抑瘤活性較強(qiáng)，抑瘤率達(dá)43.2%（10 mL/kg PO×10）；對小鼠路易斯肺癌抑瘤率達(dá)44.26%（10 mL/kg PO×10）。人體免疫功能的異常與癌癥有著密切的關(guān)系，該藥酒是否對免疫系統(tǒng)也有影響，我們通過指數(shù)來判斷效果。脾臟屬于外周免疫器官，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在維持免疫功能方面發(fā)揮重要作用。脾臟重量指數(shù)的改變能夠反映機(jī)體免疫功能的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該藥酒能夠提高小鼠脾臟重量指數(shù)，提高免疫器官的免疫功能，從而在機(jī)體抗癌作用中發(fā)揮作用。

我們對藥酒的安全性也進(jìn)行了評價(jià)。首先進(jìn)行了半數(shù)致死量（LD50）的實(shí)驗(yàn)。由于該藥酒毒性小，無法測出LD50。我們對其進(jìn)行了最大耐受量的評價(jià)，即1 d內(nèi)給予動(dòng)物最大給藥濃度和最大給藥體積來觀察藥物的安全性。限于給藥濃度和給藥體積，1 d內(nèi)給予小鼠的最大量為為18 g/ kg，14 d內(nèi)小鼠未出現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡，測得該藥物小鼠口服的最大耐受量為18 g/kg。小鼠的平均體質(zhì)量為25 g。臨床患者用量為每天100 mL，相當(dāng)于2 g粉末。按50 kg體質(zhì)量計(jì)算，小鼠的最大耐受倍數(shù)（18/25）×（50000/2），為18000。耐受倍數(shù)100以上視為安全，表明本藥酒安全性非常好，是一個(gè)很有潛力的抗癌方劑。

本文對抗癌藥酒只做了浮淺的評判，有關(guān)該藥酒的作用機(jī)制等研究尚在進(jìn)行中。

[1] 戰(zhàn)渤玉,車緒風(fēng),尉炳超.中藥酒劑的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息, 2001,27(3):120-122.

[2] 韓 銳.抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)(1版)[M].北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1997:370-380.

[3] 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)(1版)[M].人民衛(wèi)生出版社,1993:112-119;779-780.