梔子苷在大鼠體內的藥代動力學研究*

王又紅,郭琳琳,劉衛紅,李 強

(1.河南中醫學院第一附屬醫院,河南鄭州 450000;2.河南中醫學院,河南鄭州 450008)

梔子又名山梔子、黃梔子,為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實,具有利膽、鎮痛、降壓和抑菌抗炎等作用[1]。臨床常用中藥中許多方劑中含有梔子,梔子苷是梔子中具有顯著生理活性的成分。本實驗采用高效液相色譜(HPLC)法測定注射梔子苷后梔子苷在大鼠體內的血藥濃度,研究注射梔子苷后梔子苷在體內的藥代動力學特征,以期為梔子及其有效成分的合理使用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD大鼠,雄性,體質量220 g左右,由河南醫科大學動物中心提供,動物質量許可證號: SCXK(豫)2010-0002。

1.2 藥品與試劑

梔子苷對照品,購于中國藥品檢驗所,批號110749-200613;90%梔子苷,購于四川雙子葉生物科技有限公司,批號SZY081216;甲醇為色譜醇,迪馬公司產品;水為自制純凈水,其余試劑均為分析純。

1.3 儀 器

Sartorious CP 225D型電子天平,產地德國;美國Waters 2695型高效液相色譜儀(包括自動進樣系統、四元泵、在線真空脫氣、Waters 2996PDA-二極管陣列檢測器);QL-901旋渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品;BF-2000氮氣吹干儀,北京八方世紀科技有限公司產品;SZ-93自動雙重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠產品。

1.4 色譜條件[2]

Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm, 5μm),流動相為甲醇∶水(30∶70);體積流量為1.0mL/min;檢測波長為238 nm;柱溫為30℃,進樣量為10μL。

1.5 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對照品 10 mg,用甲醇溶解于10mL容量瓶中,定容至刻度,即得濃度為1 g/L的梔子苷對照品母液,將母液稀釋配制成系列質量濃度的梔子苷對照品溶液。

1.6 動物實驗方法

對SD大鼠進行頸靜脈插管手術,將術后恢復正常的健康大鼠用于梔子苷的藥代動力學實驗。給藥前將插管大鼠禁食不禁水 12 h,每只大鼠按12.5μg/g的劑量尾靜脈注射給予梔子苷,分別于給藥后 1,5,10,20,30,40,60,90,120,180 min經頸靜脈插管取血0.5m L于肝素化離心管中,6 000 r/min離心15 min,分離出血漿,-20℃保存備用。

1.7 血漿樣品預處理[2-5]

吸取 200μL血漿置離心管中,加甲醇∶乙腈(3∶1)的混合溶劑 800μL沉淀蛋白,渦旋混勻1m in,6 000 r/min離心15min,吸取上清液,氮氣氣流下吹干,殘渣加入流動相 100μL溶解,超聲5m in,15 000 r/min離心15 min,吸取上清液,進樣檢測分析。

2 結 果

2.1 專屬性試驗

在上述的色譜條件下,測得梔子苷對照品溶液、大鼠空白血漿、大鼠空白血漿加梔子苷對照品溶液及注射梔子苷后血漿樣品色譜圖(見圖1)。由圖可知梔子苷的峰形良好,保留時間約為5.2 min,分離度大于 1.5,空白血漿樣品中的內源性物質不干擾梔子苷血藥濃度的分析。

圖1 梔子苷對照品溶液、大鼠空白血漿、大鼠空白血漿加梔子苷對照品溶液及注射梔子苷后血漿樣品色譜圖

2.2 線性關系考察

取大鼠空白血漿200μL,分別加入不同濃度的梔子苷對照品溶液100μL,配制成濃度為0.1,0.2, 0.4,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0,40.0,100.0, 200.0 mg/L的標準血漿樣品,除不加 100μL甲醇外,其他按照 1.7項下的方法操作處理樣品,按1.4項中所述色譜條件下進樣測定,記錄梔子苷的峰面積,并以梔子苷的峰面積(A)對梔子苷質量濃度(C)進行線性回歸,所得梔子苷標準曲線回歸方程: A=46 573C+2 011.7(R2=0.999 6,0.1～4 mg/L)和A=43 426C+65 321(R2=0.999 2,4～200 mg/L),血漿藥物濃度在0.1～200mg/L范圍內線性關系良好,定量下線為0.1 mg/L。

2.3 回收率試驗

取空白血漿 200μL,分別制備低、中、高 3個濃度(0.2,4,100mg/L)的標準血漿樣品,按1.7項下方法處理,按 1.4項中所述色譜條件下進樣測定,平行操作 5次,以標準曲線求算實測濃度,與理論濃度進行比較,計算回收率。其低、中、高 3個濃度的回收率分別為96.37±4.05,98.82±3.08,100.49± 2.64,相對標準偏差RSD值分別為4.20%、3.12%、2.63%(n=5)。

2.4 精密度試驗

分別配制低、中、高 3個質量濃度(0.2,4.0, 100.0mg/L)的標準血漿樣品,按1.7項下方法處理,按 1.4項中所述色譜條件下進樣測定,每個濃度的樣品制備 5份,當天將樣品進行檢測,以評價日內精密度。同法連續5 d內,每天測定低、中、高 3個濃度的樣品,每個濃度 5份,以評價日間精密度。結果表明:日內精密度的 RSD值分別為5.15%、2.93%、2.37%,日間精密度的 RSD值分別為5.76%、3.16%、2.67%(n=5)。

2.5 穩定性試驗

分別取低、中、高 3個質量濃度(0.2,4.0, 100.0 mg/L)的血漿樣品,每個濃度5份,將樣品按1.7項下方法處理,于制備后 0,2,4,8,12 h按 1.4項中所述色譜條件下進樣測定,計算RSD值,3個濃度的RSD值分別為3.60%、2.04%、2.43%。結果表明標準血漿樣品室溫放置 12 h穩定性良好。同法配制低、中、高 3個質量濃度的標準血漿樣品,保存于 -20℃冰箱中,分別于 0,1,2,3,4 d取出,于室溫下融化,按所建的方法操作測定,計算RSD值、3個濃度的RSD值分別為4.19%、2.72%、2.52%。結果表明標準血漿樣品的凍存穩定性良好。

2.6 藥代動力學參數

運用3P87藥代動力學程序計算梔子苷的藥代動力學參數,按房室模型進行模擬,結合AIC值最小和相關系數 r值最大原則,結果表明,注射梔子苷后梔子苷在大鼠體內的過程符合三室模型。其藥時曲線見圖 2,主要藥代動力學參數見表 1。

圖2 梔子苷在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線

表1 梔子苷在大鼠體內的藥代動力學參數

3 討 論

本實驗在選擇液相色譜方法時,參考相關文獻[2-3,5-7],曾采用不同比例的甲醇 -水,乙腈 -水作流動相,實驗表明在甲醇∶水 -30∶70的流動相條件下,梔子苷峰形態良好,保留時間適中;血漿樣品處理過程中,由于梔子苷為環烯醚萜苷,極性較大,在乙酸乙酯中溶解性較小,因而提取回收率比較低,達不到實驗的要求,故選用有機溶劑沉淀蛋白的方法[3],嘗試用甲醇或乙腈沉淀蛋白。實驗發現用甲醇時沉淀雜質不完全,而用乙腈沉淀蛋白時實驗的回收率不高,參考文獻[4]選用甲醇、乙腈的混合溶劑作沉淀劑,實驗效果較好。本實驗建立的測定大鼠血漿中梔子苷含量的高效液相色譜法準確可靠,適合生物樣品的測定要求。通過實驗結果可知大鼠注射梔子苷后的體內藥動學過程符合三室模型, T1/2β為 38.614 min左右,說明梔子苷消除快,在體內滯留時間短;T1/2β大于T1/2α說明梔子苷在大鼠體內主要以消除過程為主。本實驗明確了注射梔子苷后梔子苷在體內的藥代動力學特征,并獲得了相關的藥代動力學參數,以期為梔子及其有效成分的合理應用提供參考。

[1]陰健.中藥現代研究與臨床應用[M].北京:學苑出版社,1993:417.

[2]丁光超,王芳芳,葉肖栗.黃連解毒膠囊中梔子苷在大鼠體內藥代動力學研究[J].西北藥學雜志,2009,24(1): 50-51.

[3]肖學鳳,喬曉莉,高嵐,等.黃連解毒湯中梔子苷在大鼠體內的藥動學研究[J].天津中醫藥,2008,25(4):328-329.

[4]高榮.銀黃注射液和銀黃口服液在大鼠體內的藥動學 -藥效學研究和代謝組學初步研究[D].成都:四川大學, 2007.

[5]楊明,陳曉燕,張海燕,等.梔子苷 4種不同給藥途徑的藥動學研究[J].中國新藥雜志,2010,19(9):746-749.

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