石藤膠囊對佐劑性關節炎大鼠關節病變的影響 *

王振亮,姚乃禮

(1.河南中醫學院仲景醫藥研究所,河南鄭州 450008;2.中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性、多關節、小關節病變為主的慢性、全身性、進行性、自身免疫性疾病,因可引起多系統、多器官的病變,又稱為類風濕病[1]。其發病機制迄今未明,也無特異性的治療藥物。筆者以補益肝腎、化痰活血通絡為治法研制了石藤膠囊,并就其對大鼠佐劑性關節炎(ad juvantarthritis,AA)關節病變的影響進行了觀察,總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,2月齡,體質量 150～180 g,由河北省實驗動物中心提供,動物質量合格證號:0804102。

1.2 藥品與試劑

石藤膠囊為院內制劑,0.5 g/粒,由河南省安陽151醫院制劑室提供,制劑批號為 070510;雷公藤多苷片,10mg/片,黃石飛云制藥有限公司產品,批號為 061101。注射用卡介苗,60 mg/支,由上海生物制品研究所提供,批號為 20080215。羊毛脂,由天津市光復精細化工研究所提供,批號為 20070923;關節組織核因子κB受體激活配體(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)大鼠ELISA試劑盒,上海西唐生物科技有限公司提供;OPG羊抗鼠和RANKL羊抗鼠,美國Santa Cruz公司產品;SP試劑盒和DAB顯色試劑盒,由北京中山公司提供。

1.3 模型的建立

動物實驗性喂養 2周后,參照文獻[2]方法,以卡介苗與不完全弗氏佐劑充分乳化混勻配成10 g/L的乳劑,于每鼠右后足跖皮內注射0.05 mL致炎。

1.4 分組與給藥

造模后第 19天,隨機選取出現多發性關節炎癥狀的大鼠 40只,并隨機分為模型對照組,石藤膠囊大、中、小劑量組,雷公藤組,每組 8只。將注射生理鹽水大鼠作為正常對照組。分別測雙側后足爪容積后,各組按每日10μL/g連續灌胃給藥或給等體積生理鹽水,持續 21 d。石藤膠囊小、中、大劑量組每日依次灌服石藤膠囊450,600,750μg/g;雷公藤組每日灌服雷公藤多苷片 6μ/g;模型對照組和正常對照組灌服等體積的生理鹽水。于給藥結束后第 2天再次測量各組大鼠足爪容積,經腹主動脈采血, 3 500 r/min離心10min,取血清,-70℃冰箱保存待測。

1.5 檢測指標

1.5.1 足爪腫脹抑制率

用適當濃度苦味酸溶液(2,4,6-三硝基苯酚)于大鼠踝關節處做一標記。測量時,將大鼠后肢浸入容積杯中使踝關節標記與液面重疊,抽吸上升液體至原液面水平,計算液體量,即為實測足爪容量。

腫脹率(%)=(致炎后足爪容積-致炎前足爪容積)/致炎前足爪容積×100%。

1.5.2 關節炎指數積分

采用關節炎指數積分法[3]。根據未注射完全佐劑的其余 3個肢體的關節紅腫程度、范圍及關節腫大變形情況,累計得出關節炎指數。0分:無關節炎。1分:關節表面有紅色斑點或關節部位輕度腫脹。2分:關節部中度腫脹。3分:關節部位嚴重腫脹。4分:關節部位嚴重腫脹,且不能負重。

1.5.3 大鼠關節病理積分

大鼠取血后立即取踝關節,用 4%多聚甲醛溶液固定,10%EDTA溶液脫鈣20 d,常規石蠟包埋切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,常規光鏡觀察滑膜增生、炎性細胞浸潤、軟骨骨質破壞及關節周圍組織水腫等組織形態變化,并根據文獻[4]方法進行半定量評分。標準如下:關節具有正常的結構(如關節間隙、軟骨、骨和滑膜組織等),計0分;關節組織中有纖毛形成和輕度的關節炎癥,并有滑膜增生,血管數量增加,以及小的炎性細胞灶,無軟骨和骨的侵蝕破壞,計 1分;關節有軟骨的侵蝕破壞,有中度的關節炎癥,有大量炎細胞浸潤,滑膜增生和血管翳形成較嚴重,無骨破壞,關節結構無破壞,計 2分;有嚴重的血管翳形成,廣泛的軟骨侵蝕破壞,可見骨破壞,關節結構破壞,計 3分。

1.5.4 大鼠關節中RANKL、OPG的表達

行免疫組化檢驗的切片二甲苯脫蠟,梯度酒精去除二甲苯后,以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次3min,0.3%過氧化氫-甲醇溶液37℃溫育45 min。純化水沖洗,PBS浸泡5m in,微波抗原修復30min。PBS洗3次,每次3 min,滴加羊抗鼠RANKL (1∶200)或羊抗鼠OPG(1∶200),4℃孵育過夜。陰性對照用PBS代替一抗。PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素化的兔抗羊二抗,37℃溫育30 min。PBS洗3次,每次3 min,滴加鏈霉素-辣根過氧化物酶標記的三抗,37℃溫育30 min。PBS洗3次,每次3 min,DAB顯色,脫水、透明中性樹膠封片。

RANKL、OPG表達的計數方法:RANKL陽性細胞為細胞膜或胞漿呈橘黃色或棕黃色,RANKL蛋白主要表達于滑膜、局部骨侵蝕處。每張切片在 400倍鏡下隨機挑選 10個視野,每個視野查 100個細胞,分別計算每個視野中RANKL陽性細胞數占該區域中細胞總數的百分數,求其平均值。OPG陽性的細胞為細胞質著色,呈顆粒狀的棕黃色或棕褐色。OPG主要由成骨細胞表達,也可見于滑膜細胞。每張切片在 400倍鏡下隨機挑選 10個視野,每個視野查100個細胞,分別計算每個視野中OPG陽性細胞數占該區域中細胞總數的百分數,求其平均值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,各組間均數比較采用單因素方差分析。方差分析前進行齊性檢驗,采用LSD進行統計。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 石藤膠囊對佐劑性關節炎大鼠足爪腫脹抑制率的影響

大鼠右后足接種完全弗氏佐劑后約9 d,前肢及左后足出現關節炎癥狀,約24 d后紅、腫等炎癥表現達到高峰。見表 1。

表1 各組大鼠足爪腫脹抑制率對比%,±s

表1 各組大鼠足爪腫脹抑制率對比%,±s

注:與模型對照組對比,**P＜0.01;與石藤膠囊大劑量組對比,#P＜0.05。

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2.2 石藤膠囊對佐劑性關節炎大鼠關節炎指數的影響

見表2。

表2 給藥前后各組大鼠關節炎指數對比 分,±s

表2 給藥前后各組大鼠關節炎指數對比 分,±s

注:與模型對照組對比,**P＜0.01;與石藤膠囊小劑量組對比,#P＜0.05。

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2.3 石藤膠囊對佐劑性關節炎大鼠關節病理積分的影響

見表3。

表3 各組大鼠踝關節病理積分對比 分,±s

表3 各組大鼠踝關節病理積分對比 分,±s

注:與模型對照組對比,*P＜0.05;與石藤膠囊大劑量組對比, #P＜0.05。

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2.4 石藤膠囊對佐劑性關節炎大鼠關節中RANKL、OPG表達的影響

見表4。

表4 各組大鼠關節中RANKL、OPG表達對比%,±s

表4 各組大鼠關節中RANKL、OPG表達對比%,±s

注:與正常對照組對比,**P＜0.01;與模型組對比,#P＜0.01;與石藤膠囊大劑量組對比,△P＜0.05;與雷公藤組對比,＊P＜0.05。

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3 討 論

中醫學無 RA病名,對其認識散見于“痹證”、“歷節”、“痛風”等病證中。本病多以肝腎虧虛為發病之本,外感之邪為發病誘因。因病程長久,久病多瘀、久病入絡,以致痰凝血瘀,痹阻絡脈,流注筋骨、關節、肌肉、血脈而為病。用補益肝腎法治療 RA可謂“正其本”。痰瘀痹阻的存在使 RA久羈難愈,而久治不愈又加重了痰瘀的痹阻,兩者形成惡性循環,故用化痰活血法治療RA可謂“暢其流”。依此筆者以補益肝腎、化痰活血通絡為法研制了石藤膠囊。方中石楠藤祛風,通絡益腎,治風痹、腰背酸痛[5];雷公藤祛風通絡,消腫止痛,可助石楠藤以通絡止痛;懷牛膝補肝腎,強筋骨,活血通經,“治腰膝骨痛,足痿筋攣”(《本草備要》);三七有散瘀止血,消腫定痛功能[6],又可助石楠藤活血之不逮,益其止痛之功能;萊菔子 “化痰除風,散邪發汗”(《本草再新》),長于利氣,既可化痰通利關節,也能防滋補礙胃之弊,與三七配伍,能化痰活血以除痰瘀之痹阻,通行經絡而止不通之疼痛。全方共奏補益肝腎、化痰活血通絡之效。

本實驗結果顯示,石藤膠囊可明顯降低 AA大鼠的足爪腫脹度,提高對關節腫脹的抑制率,在減輕滑膜的病理改變(滑膜水腫、增生和炎細胞浸潤,軟骨的破壞)方面,療效明顯優于雷公藤多苷,且隨著用藥量的增加,效果越明顯。RA關節的破壞包括滑膜、軟骨、軟骨下骨的侵蝕,雖然對造成這些關節破壞的機制尚未完全闡明,但破骨細胞(osteoclast, OC)在其中的作用已被大量的實驗所證實[7]。它所介導的骨破壞是通過細胞間相互作用和多種細胞因子調控實現的,其中RANKL/OPG系統處于中心地位,RANKL可以直接激活OC細胞膜上的NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)。OPG又稱破骨細胞抑制因子,主要抑制OC的分化、活化成熟以及細胞數量,是RANKL的天然阻滯受體,可阻斷其與RANK的結合[8]。有學者[9]發現,在RA患者骨關節中RANKL的表達相對OPG局限,大多分布于破骨細胞介導的骨質破壞處,即關節面血管翳與骨的交界處。OPG可在滑膜組織多數細胞中表達,但具有傾向分布于有RANKL表達的骨質破壞處的特點,這也進一步說明了 OPG阻滯RANKL對骨破壞的作用。目前認為RANKL是前體破骨細胞分化、成熟的啟動因子[10]。臨床觀察也發現[11],RA患者血清、滑液中OPG水平降低, RANKL、RANK水平升高。本實驗觀察到,AA大鼠的滑膜、軟骨下骨、骨小梁局灶侵蝕處可見RANKL表達增高,在軟骨下骨、骨小梁區域有OPG的高表達,這和文獻報道[12-13]一致。實驗結果還表明,關節中OPG的表達水平模型對照組明顯低于正常對照組,RANKL的表達水平模型對照組明顯高于正常對照組,證明AA的關節骨質破壞是由破骨細胞通道激活所引起的。石藤膠囊各劑量組的OPG表達明顯高于模型對照組,RANKL表達明顯低于模型對照組,石藤膠囊中、小劑量組與模型對照組對比,差別也有統計學意義(P＜0.05),但療效不及大劑量組。表明石藤膠囊在保護 AA骨破壞方面有良好效果,同時有一定的量效關系。石藤膠囊通過抑制破骨細胞通道防治骨破壞可能是其治療RA的作用機制之一。

雷公藤多苷是我國自行開發的抗風濕藥,對RA有較好療效。本實驗表明石藤膠囊改善關節腫脹的效果好于雷公藤多苷(P＜0.01),改善RANKL、OPG指標方面與雷公藤多苷相當(P＞0.05),說明石藤膠囊對 AA有明顯效果,值得進一步研究。

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