熱補針法對關節炎兔的鎮痛后效應及其腦脊液中 β-EP和CCK-8含量的影響*

杜小正,方曉麗,東貴榮

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院針灸科,上海 200437;2.甘肅中醫學院針灸推拿系,甘肅蘭州 730000)

筆者前期的實驗研究結果證明,熱補針法即時鎮痛效應與捻轉針法相同,而后效應優于捻轉針法,并證明與外周炎癥局部鎮痛物質的變化也有關[1-2],推測兩種針法不同的鎮痛后效應與中樞鎮痛物質的變化也有關。筆者以卵蛋白誘導的關節炎兔為疼痛模型,探求熱補針法的針刺鎮痛后效應及中樞作用機制,以期為臨床治療痛證提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康2～3月齡青紫藍兔 70只,體質量(2.5± 0.5)kg,雌雄各半,由衛生部蘭州生物制品研究所實驗動物中心提供,動物質量合格證號:醫動字第甘肅省14-021號。

1.2 主要儀器與試劑

SN-695B型智能放免γ測量儀,上海日環產品;FA2004N型電子分析天平,上海精密科學儀器有限公司產品;TG-16G型臺式離心機,上海安亭產品;WQ-9E測痛儀,北京海淀區電子儀器廠產品;卵蛋白干粉及完全弗氏佐劑,上海升正產品,批號為200712;β-EP、CCK-8放免試劑盒,第二軍醫大學神經生物教研室產品。

1.3 動物分組

將已馴養1周并測痛閾在1.8mA左右、能引起縮腿反應的 60只青紫藍兔用于實驗。痛閾測定小于1.30mA或大于2.30 mA者為動物反應過敏或遲鈍,棄之不用。將 60只兔按體質量隨機分為正常組(n=6)、模型組(n=6)、捻轉組(n=24)和熱補組(n=24),后2組又隨機分為針后即時(0 h)和針后0.5,1,2 h亞組,每亞組各6只。

1.4 動物模型的建立

模型組以及捻轉組、熱補組各亞組均采用卵蛋白誘導法建立關節炎疼痛模型[3]。方法:于造模前3 d用脫毛劑脫去家兔雙側后腿膝關節周圍和背部肩胛骨間的毛。將4 g/L的卵蛋白溶液與等量完全弗氏佐劑混勻,充分震蕩成乳化劑。在兔肩背部均勻選6個點,每點皮下注射該溶液0.2 mL。14 d后以相同劑量重復皮下注射 1次。第 2次免疫后 6 d,在兔雙膝關節內分別注入 20 g/L卵蛋白生理鹽水溶液0.4mL。在24 h之內關節出現紅腫,表示造模成功。

1.5 針刺治療

在兔雙膝關節內注入卵蛋白生理鹽水溶液后第7天針刺治療雙側后腿足三里和雙側前腿的合谷穴(取穴參照林文注《實驗針灸學》家兔常用針灸穴位定位標準并以對比解剖學為依據定位)1次。方法:將針直刺入穴內 0.8～1.2 cm,捻轉組施以前后捻轉的手法,指力均勻,角度適當(180～360度),雙向捻轉,每穴操作1min,留針30 min;熱補組用熱補針法,右手拇指向前連續捻按針柄 3～5次,待針下沉緊,針尖拉著有感應的部位,連續重插輕提 3～5次,拇指再向前連續捻按針柄 3～5次,針尖頂著產生感覺的部位守氣1min,留針30min。正常組和模型組青紫藍兔以同樣的方式固定30min,不做其他處理。

1.6 檢測指標

痛閾:各治療組在治療后即時、0.5 h、1 h和2 h測痛閾。檢測方法參照文獻[4]。在右膝關節表面安裝含有飽和KCL溶液的電極,無關電極接右前肢,兩極與WQ-9E測痛儀相連,用電流強度線型遞增的直流電將 K+導入皮膚,做疼痛刺激。以右后腿的收縮性反應作為疼痛指標,以引起家兔腿收縮的最小電流強度作為痛閾。共測 3次,每次之間間隔5 min,取其平均值作為痛閾。

β-EP、CCK-8:測完痛閾后將家兔以30%烏拉坦按1 g/kg經耳緣靜脈注射麻醉,取側臥位用7號靜脈穿刺針經枕外隆凸下 0.5 cm處進入小腦延髓池,抽取腦脊液 1m L,注入提前浸在冰浴中的收集管中,立即在沸生理水中煮5 min,4℃,4 000 r/min離心 20 min,取上清液,-20℃低溫保存待測。采用放射免疫技術測定β-EP和CCK-8的含量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 13.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,各組間均數對比用單因素方差分析(ANOVA),組間均數的兩兩對比,方差齊時選擇LSD法,方差不齊時選擇Dunnett T3法。以 P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 熱補針法對家兔關節局部痛閾值的影響

模型組痛閾顯著低于正常組(P＜0.01);與0 h模型組對比,捻轉組和熱補組針后各時刻痛閾均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05),但均低于0 h正常組(P＜0.01);熱補組即時痛閾與捻轉組即時痛閾對比,差別無統計學意義 (P＞0.05);熱補組其他時間點痛閾均顯著高于捻轉組(P＜0.05或P＜0.01)。見表 1。

表1 各時間點各組家兔關節局部痛閾值對比 mA,±s

表1 各時間點各組家兔關節局部痛閾值對比 mA,±s

注:與0 h正常組對比,**P＜0.01;與0 h模型組對比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉組相同時間點對比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.2 熱補針法對家兔腦脊液中β-EP含量的影響

模型組腦脊液中β-EP含量高于正常組(P＜0.01);與 0 h模型組對比,捻針組和熱補組各時刻β-EP含量均顯著性升高(P＜0.01);熱補組即時β-EP含量與捻轉組即時 β-EP含量對比差別無統計學意義(P＞0.05);其他時刻β-EP含量,熱補組均明顯高于捻轉組(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 各時間點各組家兔腦脊液中β-EP含量對比 mg·L-1,±s

表2 各時間點各組家兔腦脊液中β-EP含量對比 mg·L-1,±s

注:與0 h正常組對比,**P＜0.01;與0 h模型組對比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉組相同時間點對比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.3 熱補針法對家兔腦脊液中CCK-8含量的影響

模型組腦脊液中CCK-8含量顯著低于正常組(P＜0.01);與0 h模型組對比,捻針組和熱補組各時刻CCK-8含量有顯著回升(P＜0.01或P＜ 0.05),但均顯著低于正常組(P＜0.01);熱補組即時、0.5 h CCK-8含量與模型組對比差別無統計學意義(P＞0.05),而熱補組1 h、2 h CCK-8含量顯著高于捻轉組(P＜0.05,P＜0.01)。見表3。

表3 各時間點各組家兔腦脊液中CCK-8含量對比 mg·L-1,±s

表3 各時間點各組家兔腦脊液中CCK-8含量對比 mg·L-1,±s

注:與0 h正常組對比,**P＜0.01;與0 h模型組對比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉組相同時間點對比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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3 討 論

痛閾是目前被廣泛采用以判斷鎮痛效果的指標。本研究結果顯示,經針刺治療后,捻轉組和熱補組各時刻關節局部痛閾均顯著高于模型組,提示捻轉針法和熱補針法的鎮痛效應均至少持續 2 h以上,這與某些報道[5]不一致。熱補針法的即時鎮痛效應與捻轉針法對比差別無統計學意義(P＞0.05),但熱補組針后0.5 h、1 h、2 h的痛閾顯著高于捻轉組(P＜0.01或P＜0.05),說明熱補針法的鎮痛后效應優于捻轉針法。

針刺鎮痛的原理是多方面的,無論用手捻針或電針,其中激活中樞內源性阿片肽(EOP)的釋放起著關鍵性的作用[6-7]。β-EP為內啡肽家族成員之一,研究證明針刺通過促進中樞和外周 β-EP的釋放參與了針刺鎮痛過程[2,8]。本實驗證實,經過治療后兩治療組即時痛閾在升高的同時,腦脊液中β-EP含量均有上升,而且熱補組0.5 h、1 h、2 hβ-EP含量顯著高于捻轉組,與痛閾的變化呈正相關,提示腦脊液中β-EP不但參與針刺鎮痛,而且與熱補針法和捻轉針法鎮痛后效應有差異相關聯。

針刺引起阿片肽釋放的同時也引起中樞抗阿片肽的釋放,中樞神經系統中阿片和抗阿片的相互作用是決定針刺鎮痛效果優劣的決定性因素之一[9]。CCK-8是目前已知的作用最強的內源性抗阿片肽,是中樞抗阿片鎮痛的物質之一。研究[10-11]表明:加強腦內CCK基因表達,可以降低針刺鎮痛效果;抑制其基因表達,則可提高針刺效應。在本實驗條件下,經過治療后兩治療組即時 CCK-8含量均有回升,熱補組1 h、2 h CCK-8含量顯著高于捻轉組,與痛閾和 β-EP的變化趨勢相同,說明針刺可促使CCK-8在中樞的釋放向正常水平恢復,而且CSF中CCK-8與形成熱補針法和捻轉針法不同鎮痛后效應有關。

總之,本實驗結果表明,熱補針法有非常顯著的鎮痛后效應,熱補針法鎮痛后效應優于捻轉針法,腦脊液中β-EP和CCK-8含量變化與兩種針法鎮痛后效應不同有明顯相關趨勢。

[1]杜小正,秦曉光,趙彬元,等.傳統“熱補”針法對實驗性關節炎兔的鎮痛效應及腦脊液中β-EP、CCK-8含量的影響[J].針刺研究,2006,31(2):86-89.

[2]杜小正,秦曉光,方曉麗.熱補針法鎮痛后效應及其對關節局部組織β-內啡肽和前列腺素 E2的影響[J].針刺研究,2009,34(5):319-323.

[3]Tominaga K,Alstergren P,Kurita H,et al.Clinical course of an antigen-induced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint[J].Oral Pathol Med,1999,28:268-273.

[4]藍敏,沈慶旗,王巧云.半導體激光對兔骨折后痛閾的影響[J].江蘇大學學報:醫學版,2003,13(2):160-162.

[5]梁繁榮,羅榮,劉雨星,等.電針鎮痛后效應與炎癥局部5-HT、NE、DA含量關系的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2001,7(11):52-55.

[6]Mayer DJ,Price DD,Rafii A,et al.Antagonism of acupuncture anal-gesia in man by the narcotic antagonist naloxone[J]. Brain Res,1977,121(2):368.

[7]Cheng RS,Pomeranz B.E lectroacupunctureanalgesia could bemediated by at least two pain relieving mechanisms:endorphin and non-endorphin system[J].Life Sci,1979,25 (23):1957.

[8]陳謹,劉光譜,周春陽.下丘腦β-EP及POMC mRNA的表達在針刺鎮痛后效應中的作用[J].針刺研究,2004, 29(1):5-9.

[9]韓濟生.中樞阿片肽和膽囊收縮素功能活動的消長是決定針刺鎮痛有效性的重要因素[J].北京醫科大學學報, 1996,28(5):321.

[10]Tang NM,Dong HW,Wang XM,et al.Cholecystokinin antisense RNA increases the analgesic effect induced by electroacupuncture or low dosemorphine:conversion of low responder rats into high responders[J].Pain,1997,71 (1):71-80.

[11]Lee G,Rho S,Shin M,etal.The association of cholecystokinin-A receptor expression with the responsiveness of electroacupuncture analgesic effects in rat[J].Neurosci Lett,2002,25(1):17-20.