通心脈方對大鼠心肌缺血再灌注損傷AKt及p38αMAPK蛋白表達的影響*

鄭曉丹,嚴世蕓,秦仲君

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院心內科,上海 200021;2.上海中醫藥大學基礎醫學院,上海 201203; 3.九江學院基礎醫學院病理生理教研室,江西九江 332000)

通心脈方由黃芪、川芎、血竭等 5味藥物組成,是上海中醫藥大學嚴世蕓教授在長期的醫療實踐中總結出的治療冠心病的經驗方,臨床療效顯著。前期研究顯示,通心脈方能顯著改善大鼠離體心臟缺血再灌注后心功能。本研究采用Langendorff離體心臟灌流方法模擬缺血再灌注模型,觀察通心脈方對缺血再灌注大鼠心肌p-p38αMAPK、p-AKt及caspase-3等的影響,進一步探討通心脈方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級健康Wistar大鼠96只,雄性,10周齡,體質量(300±20)g,購于中國科學院上海實驗動物中心,實驗動物質量合格證號:SYXK(滬)2007-2008。將動物按每籠 5～6只分籠飼養,實驗期間提供足量的自來水及上海中醫藥大學實驗動物中心提供的普通飼料,動物室保持 22℃,自然通風,相對濕度60%～70%,光照周期8:00-20:00。適應7 d后用于實驗。

1.2 儀 器

ML176型Langendorfff離體心臟灌流裝置, ML785型生物信號處理和分析系統,MLT1050型高精度壓力換能器,產地澳大利亞;SPECTERA max190型Molecular Device酶標儀,產地美國;S-450D型BRANSON超聲組織破碎儀,產地美國;HP圖像掃描儀,產地日本;Smart View圖像分析軟件,上海復日科技有限公司產品。

1.3 藥品與試劑

通心脈方由黃芪(產地內蒙)、川芎(產地四川)、血竭(產地云南)等5味藥組成,全方共計生藥52 g,購于北京同仁堂上海黃浦大藥房。藥品經上海中藥標準化中心鑒定后,由上海中醫藥大學中藥研究所采用醇提法提取,全方得率 29.57%。所得藥液用含0.5%甲基纖維素的雙蒸水配制,高、中、低劑量通心脈方混懸溶液分別含生藥 1.7,0.85, 0.45 g/m L。卡維地洛,10mg/片,齊魯制藥有限公司產品,批號 20091117。p-p38αMAPK(Thr180/ Tyr182,9216)、p38αMAPK(9217)、p-AKt(Ser473, 4051)、AKt(2920)抗體,均購于Cell Signaling Technology公司;caspase-8(Lot40513)、caspase-3(Lot50706)分光光度法活性檢測試劑盒,購于Biovision公司;大鼠TNF-αELISA試劑盒及兔抗GAPDH多克隆抗體(Lot20101013),購于妙通(上海)生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)(Lot20100916)、丙二醇(MDA)(Lot20100915)、過氧化氫酶(CAT) (Lot20100823)試劑,購于南京建成生物工程研究所;其余試劑均為國產或進口分析純。

1.4 動物分組

實驗分 2批進行。第 1批:將 48只大鼠隨機分為正常灌流組、缺血再灌注組、通心脈方大劑量組、通心脈方中劑量組、通心脈方小劑量組、卡維地洛組6組,每組 8只。正常灌流組全過程用 K-H液恒速持續灌流120 min,其余組心臟平衡10 min后停灌50min,再灌注60min。實驗結束后取左室心肌液氮速凍后于 -80℃冰箱保存,用于caspase-8、caspase-3、SOD、CAT、MDA及TNF-α含量測定。第2批:分組同第 1批。正常灌流組全過程用 K-H液(單位為mM,NaCl 118,KCl 4.7,CaCl21.25, NaHCO325,KH2PO41.2,MgSO41.2,Glucose 11,pH 7.4,持續充以95%O2和5%CO2)恒速持續灌流75min,其余組心臟平衡10 m in后停灌50 min,再灌注15min(據文獻[1]報道,p-p38αMAPK及p-AKt最大激活在缺血再灌注15min)。實驗結束后,取左室心肌液氮速凍后于-80℃冰箱保存,用于p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白表達的檢測。

1.5 給藥方法

根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”[2]折算,正常灌流組、缺血再灌注組予以生理鹽水10μL/(g·d)灌胃,通心脈方大、中、小劑量組分別予含生藥10.4,5.7,2.9 g/(kg·d)醇提物灌胃,卡維地洛組予以2μg/(g·d)灌胃,連續15 d。

1.6 模型的建立

造模方法參照文獻[3]方法加以改進。大鼠末次給藥后60min造模,腹腔注射肝素1 000U/kg抗凝,20min后腹腔注射戊巴比妥鈉50μg/g麻醉,開胸,取出心臟固定于Langendorff裝置上,用K-H液恒溫恒流(37℃,12 mL/min)灌流。用眼科剪在左心耳根部剪 1個小口,將球囊通過左心耳插到左心室。向球囊內注入生理鹽水,平衡期調整左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)于8～10mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)之間。導管連接壓力換能器,用 8道生理信號分析儀連續記錄整個實驗過程中左室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室發展壓(Left ventricular development pressure,LVDP)、LVEDP、冠脈灌注壓(coronary perfusion pressure,CPP)、左室內壓最大變化速率(Peak positive and negativemaximal derivation of left ventricular pressure,±dp/dtmax)數值。

1.7 檢測指標

心肌組織SOD、CAT及MDA含量的測定,采用分光光度法檢測。心肌組織p-p38αMAPK、p38α MAPK、p-AKt及AKt蛋白的表達,用Western b lot檢測,利用樣本目的蛋白的光密度比內參照基因條帶的光密度,對比不同樣本的相對表達率。心肌組織TNF-α含量的變化,采用ELISA法測定。心肌組織caspase-8、caspase-3活性的表達,采用分光光度法檢測。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,多組計量資料對比采用單因素方差分析,多組間兩兩對比采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 通心脈方對各組大鼠SOD、CAT及MDA的影響

與缺血再灌注組對比,正常灌流組、通心脈方大劑量組及卡維地洛組SOD、CAT含量升高,而MDA含量降低,差別有統計學意義(P＜0.01或 P＜0.05)。與正常灌流組對比,缺血再灌注組,通心脈方大、中、小劑量組及卡維地洛組SOD含量降低,差別有統計學意義(P＜0.01);缺血再灌注組,通心脈方中、小劑量組及卡維地洛組 CAT含量降低,差別有統計學意義(P＜0.01),而通心脈方大劑量組較之差別無統計學意義(P＞0.05);缺血再灌注組,通心脈方中、小劑量組MDA含量升高,差別有統計學意義(P＜0.01),而通心脈方大劑量組及卡維地洛組較之差別無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌組織SOD、CAT及MDA水平的對比 ±s

表1 各組大鼠心肌組織SOD、CAT及MDA水平的對比 ±s

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注:與缺血再灌注組對比,*P＜0.05,**P＜0.01;與正常灌流組對比,##P＜0.01。

2.2 通心脈方對各組大鼠心肌組織p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白的影響

見圖1-2。

圖1 各組大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白表達

2.3 通心脈方對各組大鼠 p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt與GAPDH比較的相對表達水平對比

各組間p38αMAPK及AKt表達對比,差別無統計學意義(P＞0.05)。與缺血再灌注組對比,其余各組p-p38αMAPK蛋白表達減少,差別有統計學意義(P＜0.01),通心脈方大劑量組及卡維地洛組p-AKt蛋白表達增加,差別有統計學意義(P＜0.05)。與正常灌流組對比,缺血再灌注組及通心脈方小劑量組p-p38αMAPK蛋白表達明顯增加,差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05),其余各組p-AKt蛋白表達增加,差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt與GAPDH比較的相對表達水平對比 ±s

表2 各組大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt與GAPDH比較的相對表達水平對比 ±s

注:與缺血再灌注組對比,*P＜0.05,**P＜0.01;與正常灌流組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 動物數 p-p38αMAPK p38αMAPK p-AKt AK t缺血再灌注組 4 1.68±0.23## 0.87±0.27 0.99±0.18# 0.85±0.21正常灌流組 4 0.37±0.11** 0.86±0.08 0.54±0.20** 0.89±0.12通心脈方大劑量組 4 0.60±0.14** 0.82±0.21 1.44±0.32*## 0.79±0.16通心脈方中劑量組 4 0.62±0.14** 0.84±0.09 1.14±0.13## 0.87±0.10通心脈方小劑量組 4 1.05±0.15**## 0.78±0.08 0.81±0.05# 0.83±0.11卡維地洛組 4 0.62±0.04** 0.80±0.22 1.35±0.16*## 0.89±0.35

2.4 通心脈方對各組大鼠心肌組織TNF-α水平的影響

與缺血再灌注組對比,正常灌流組、通心脈方大劑量組及卡維地洛組TNF-α含量明顯降低,差別有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α水平對比 ±s

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α水平對比 ±s

注:與缺血再灌注組對比,*P＜0.05。

組 別 動物數 TNF-α/(μg·L-1)缺血再灌注組 8 473.62±151.88正常灌流組 8 222.47±71.51*通心脈方大劑量組 8 242.33±49.30*通心脈方中劑量組 8 339.35±101.17通心脈方小劑量組 8 401.38±114.87卡維地洛組 8 279.73±34.11*

2.5 通心脈方對各組大鼠心肌組織caspase-8及caspase-3活性的影響

以正常灌流組作為未誘導凋亡組,其余各組與正常灌流組比較數值作為caspase-8的活性。與缺血再灌注組對比,通心脈方大劑量組及卡維地洛組caspase-8及caspase-3活性明顯降低,差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織caspase-8及caspase-3活性對比±s

表4 各組大鼠心肌組織caspase-8及caspase-3活性對比±s

注:與缺血再灌注組對比,*P＜0.05,**P＜0.01。

組 別 動物數 caspase-8 caspase-3缺血再灌注組 8 2.74±0.48 2.96±0.81通心脈方大劑量組 8 1.14±0.23** 1.33±0.43*通心脈方中劑量組 8 2.32±0.73 3.04±1.23通心脈方小劑量組 8 3.20±0.52 3.92±1.17卡維地洛組 8 1.36±0.33** 1.07±0.23*

3 討 論

心肌缺血再灌注中細胞凋亡現象首先見于1994年Gottlieb等[4]的報道。氧自由基(oxygen free radical,OFR)是一種終末損傷介質。大量資料表明,OFR產生過多和(或)清除能力下降在心肌缺血再灌注的機制中占有重要地位。缺血再灌注期間OFR可激活p38MAPK,且最大激活發生在再灌注10 min。p38αMAPK和p38βMAPK激活后效應相反,p38αMAPK加重心肌損傷,而p38βMAPK起保護心肌的作用[1]。TNF-α是一種主要的炎癥細胞因子,能產生多種生理效應,在心肌缺血再灌注損傷的病理生理發展過程起到重要作用。心肌缺血再灌注時,TNF-α表達水平顯著增加,伴有心功能的惡化和細胞凋亡[5]。凋亡啟動亞類蛋白酶caspase-8是聯系受體與胞漿執行分子的重要環節,當細胞膜表面的TNF-α與其配體TNFRI結合后,受體發生多聚化,通過自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶,進而導致下游蛋白酶凋亡效應亞類caspase-3的激活,執行剪切細胞結構蛋白作用,直接使細胞發生凋亡[6]。

AKt在阻止細胞凋亡、調節糖代謝和蛋白合成等過程中均起著十分關鍵的作用。將離體大鼠心臟予以缺血預處理可顯著增加AKt磷酸化,減少心肌梗死面積,予以PI-3K阻滯劑LY-294002可抑制缺血預處理介導的心肌保護作用[7]。

現代研究表明,通心脈方中的黃芪及川芎對大鼠心肌的保護可能與改善缺血再灌注冠狀動脈微循環和清除氧自由基生成等機制有關[8-10]。本研究結果顯示,心肌缺血再灌注后心肌組織中MDA及TNF-α大量生成,caspase-8及caspase-3活性顯著升高,再灌注10 min明顯激活p38αMAPK;通心脈方可顯著升高心肌組織中SOD及CAT活性而降低MDA及TNF-α含量,同時使caspase-8及caspase-3活性明顯降低。結果提示,通心脈方減輕心肌缺血再灌注損傷及細胞凋亡的機制可能與減輕缺血再灌注后心肌細胞脂質過氧化反應,抑制p38αMAPK的活性,減少 TNF-α的翻譯和合成,阻斷受體依賴性死亡級聯反應以及同時激活細胞增殖信號AKt有關。

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