彭澤鯽葡萄糖激酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆及表達(dá)分析

程漢良 姬南京 彭永興 申 欣 吳陳晨 許建和 董志國(guó)

(淮海工學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005)

葡萄糖激酶(glucokinase，GK，EC2.7.1.1)是糖代謝的關(guān)鍵酶，催化葡萄糖磷酸化生成6－磷酸葡萄糖(glucose-6-phophate，G-6-P)，這是糖元合成和糖酵解的第1步反應(yīng)［1］。GK屬己糖激酶(hexokinase，HK)家族成員之一，哺乳動(dòng)物己糖激酶有同工酶Ⅰ～Ⅳ型，其中，Ⅰ～Ⅲ型主要存在于肝外組織，其Km值(Km值等于酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度1/2時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度，是酶的特征常數(shù)之一)為20～130μmol/L，G-6-P是其反饋抑制物;Ⅳ型主要存在于肝臟和胰島β細(xì)胞，通常稱之為GK。與其他3種已糖激酶相比，GK對(duì)葡萄糖的親和力較低，其Km值為5～8 mmol/L，G-6-P對(duì)此酶無(wú)抑制作用［2］。當(dāng)血糖濃度升高時(shí)啟動(dòng)GK，于是多余的葡萄糖最終被轉(zhuǎn)化為糖原或脂肪貯存，胰島素在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控GK基因表達(dá)［3］，GK 基因突變可引起人類患 2 型糖尿病［4］。在魚類中，特別是肉食性魚類，對(duì)飼料中可消化碳水化合物作為能量供應(yīng)的能力非常有限［5－6］，一些魚類攝食富含碳水化合物飼料后會(huì)出現(xiàn)高血糖癥［7－8］，飼料碳水化合物過高還可能是誘發(fā)養(yǎng)殖魚類脂肪肝病發(fā)生的原因之一［9］，而GK基因因可能與上述問題有關(guān)而受到重視。目前，研究人員已對(duì)魚類GK基因進(jìn)行了一些研究，克隆了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、金鯛(Sparus aurata)、翹嘴紅鮊(Erythroculter ilishaeformis)等魚類的GK基因全長(zhǎng) cDNA 序列［10－12］，并對(duì)影響 GK 基因表達(dá)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境等因素進(jìn)行了研究，為魚類碳水化合物代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

彭澤鯽(Carassius auratus var.Pengze)是我國(guó)鯽魚主要養(yǎng)殖品種。近幾年，隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高，用于魚類飼料蛋白質(zhì)源的魚粉資源不斷減少。因此，優(yōu)化飼料配方，提高碳水化合物用于能量消耗的比例，節(jié)約蛋白質(zhì)的消耗，促進(jìn)養(yǎng)殖魚類健康生長(zhǎng)，預(yù)防脂肪肝病的發(fā)生成為魚類營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。本研究從彭澤鯽肝胰臟中克隆GK基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其組織表達(dá)進(jìn)行研究，以期為通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控魚類GK基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。由于GK把糖代謝和脂肪合成關(guān)聯(lián)起來，因此，通過對(duì)GK基因的研究還可為探討魚類脂肪肝發(fā)生的營(yíng)養(yǎng)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用彭澤鯽于2008年5月采自江蘇連云港市羅陽(yáng)鎮(zhèn)的精養(yǎng)魚池，2齡，體重0.3～0.5 kg。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于全自動(dòng)水族箱中25℃暫養(yǎng)，適量投喂商品顆粒飼料，并于喂食后6 h取樣。

1.2 肝胰臟總RNA的提取

取彭澤鯽活體解剖，快速分離肝胰臟，液氮研磨，采用 E.Z.N.A.TMTotal RNA kit I(OMEGA，USA)按推薦方法提取肝胰臟總 RNA，按膜上DNaseⅠ(OMEGA，USA)消化處理方案去除基因組DNA污染，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，核酸定量?jī)x(PE，USA)檢測(cè)RNA濃度，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋至1μg/μL，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA第1鏈的合成和GK基因cDNA核心片段序列的克隆

以彭澤鯽肝胰臟總RNA為模板，Oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(BBI，Canada)推薦方法合成cDNA第1鏈，20μL反應(yīng)體系中含:彭澤鯽肝胰臟總RNA(1 μg/μL)5 μL、Oligo(dT)181 μL、DEPC 水5 μL、5×Buffer 4 μL、RNase抑制劑 1 μL、dNTP(10 mmol/L)2μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2μL。根據(jù)GenBank中斑馬魚(Danio rerio，BC122359)和鯉魚(AF053332)GK基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)基因特異性引物GK-F和GK-R，并根據(jù)斑馬魚 GK基因序列預(yù)測(cè)PCR產(chǎn)物大小(表1)，以上述第1鏈cDNA稀釋10倍為模板，PCR擴(kuò)增彭澤鯽GK基因一段855 bp的核心序列，50μL反應(yīng)體系中含:模板2μL、濃度為25μmol/L的上下游引物各1μL、10×Buffer 5μL、濃度為 25 mmol/L的 Mg2+4μL、濃度為 25 mmol/L的 dNTP 1μL、濃度為5 U/μL的Taq酶0.4 μL，去離子水補(bǔ)充至50 μL。擴(kuò)增條件為:94℃變性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán);反應(yīng)前 94℃預(yù)變性4 m in;反應(yīng)后72℃充分延伸7 m in。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選5個(gè)PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(上海生工)采用擴(kuò)增引物進(jìn)行正反雙向測(cè)序。正反序列組裝后得到GK基因的核心序列，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)3'cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)和5'RACE的引物。

表1 用于GK基因cDNA RT-PCR和RACE的引物序列及預(yù)期產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence and expected product size for GK gene cDNA RT-PCR and RACE

1.4 彭澤鯽GK基因3'RACE

使用 TaKaRa的3'-Full RACE Core Set試劑盒，按推薦方法快速擴(kuò)增GK基因3'末端，3'RACE使用的引物見表1。首先，以O(shè)ligo(dT)16AP為引物反轉(zhuǎn)錄肝胰臟總RNA，獲得cDNA第1鏈，稀釋10倍后，以GK3-F1和AP為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后，用GK3-F2與Race3-R進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和條件同核心序列的擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶，膠回收方法采用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BBI，Canada)推薦方法;然后用 PCR Product Cloning Kit(BBI，Canada)推薦方法將回收的 PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有青霉素，并涂有IPTG和X-gal的LB平板上培養(yǎng)16～20 h，挑白斑在含青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)16 h，使用EZ-10 Spin Column Plasm id M ini-preps Kit(BBI，Canada)提取質(zhì)粒，用 GK3-F2和Race3-R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選5個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工采用M 13通用引物雙向測(cè)序。

1.5 彭澤鯽GK基因5'RACE

參考 Dieffenbach等［13］的方法快速擴(kuò)增 GK基因5'末端，5'RACE使用的引物見表1。首先，以GK5-R為引物反轉(zhuǎn)錄肝胰臟總RNA，獲得cDNA第1鏈;然后用RNase H(Fermentas，Canada)分解cDNA-RNA雜交體中的RNA，乙醇沉淀;再使用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(Fermentas，Canada)在5'端加多聚A(polyA)尾，20μL反應(yīng)體系如下:在有沉淀的原管中加入5×Buffer 4μL、dATP(100 mmol/L)1μL、末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(20 U/μL)1.5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)至 20 μL。反應(yīng)條件為:37℃溫育30 m in，70℃滅活10 m in，用 TE緩沖液稀釋10倍后備用;最后，以O(shè)ligo(dT)16AP和GK5-R1為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后，用Race3-R與GK5-R2進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和條件同核心序列擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶并回收，克隆測(cè)序，方法同3'RACE。

1.6 序列分析

用 DNAstar Package(Version 5.01)軟件包中的SeqMan對(duì)正反序列進(jìn)行組裝，當(dāng)正反序列出現(xiàn)不配對(duì)情況時(shí)，查閱熒光圖譜進(jìn)行校正，分別得到GK基因cDNA的核心序列、3'末端序列和5'末端序列，然后用SeqMan將3段序列組裝成完整的GK基因全長(zhǎng)cDNA序列。用EditSeq對(duì)得到的序列進(jìn)行編輯和分析，尋找開放閱讀框(ORF)，并使用脊椎動(dòng)物密碼子翻譯成氨基酸序列。通過查詢http://www. predictprotein.org/和 http//www.EMBL-Heidelberg.de對(duì)編碼蛋白質(zhì)的2級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);從GenBank下載6種魚類、10種哺乳類、1種鳥類和1種兩棲類動(dòng)物的GK氨基酸序列，與本研究獲得的彭澤鯽氨基酸序列用MEGA Version 3.1采用鄰接(neighbor-joining，NJ)法(Amino:pdistance model，10 000 replicates，boostrap phylogeny test)［14］構(gòu)建基于 GK氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 彭澤鯽GK基因在不同組織的表達(dá)

取3尾彭澤鯽活體解剖，快速分離大腦、白肌、脾臟、腸系膜脂肪和肝胰臟等組織，分別提取總RNA，按膜上DNaseⅠ消化處理方案去除基因組DNA污染，1%變性瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，用DEPC水稀釋至1μg/μL。分別以O(shè)ligo(dT)18反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，稀釋10倍，用 GK-F1與 GK-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，用Actin-F和Actin-R為引物(表1)在不同管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μL反應(yīng)體系中含:模板1μL、濃度為25μmol/L的上下游引物各 0.5μL、10×Buffer 2.5μL、濃度為25 mmol/L 的 Mg2+2 μL、濃度為 25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μL、濃度為5 U/μL的Taq酶0.2 μL，去離子水補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸40 s，共28個(gè)循環(huán);反應(yīng)前 94℃預(yù)變性4 m in;反應(yīng)后72℃充分延伸7 m in。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。為避免樣品中的DNA污染，各組均設(shè)以總RNA為模板的陰性對(duì)照1個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 彭澤鯽GK基因全長(zhǎng)cDNA序列分析

對(duì)GK cDNA核心序列以及克隆的3'RACE和5'RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分別得到長(zhǎng)度為855、965和373 bp核苷酸片段。將上述3段序列進(jìn)行組裝，去掉重復(fù)序列后得到彭澤鯽GK基因全長(zhǎng) cDNA序列，并提交 GenBank(登錄號(hào):GU065315)，其全序列和推測(cè)的氨基酸序列如圖1所示。該cDNA全長(zhǎng)2 050 bp(不含polyA)，含有1 431 bp的完整開放閱讀框，編碼476個(gè)氨基酸，其中，5'端非翻譯區(qū) 67 nt，3'端非翻譯區(qū) 552 nt。在啟始密碼子ATG的－3位為A，－6位為G，符合Kozak規(guī)則，在該閱讀框終止密碼子TGA下游有典型的AATAAA加尾信號(hào)，這些都符合有效翻譯基因全長(zhǎng)cDNA的特征。

彭澤鯽GK蛋白計(jì)算分子量為53.78 ku，等電點(diǎn)為5.14。其氨基酸序列中可能的基序包括:1個(gè)己糖激酶標(biāo)簽序列(hexokinases signature)，Leu156-Phe181;2個(gè)N－連接糖基化位點(diǎn)(N-linked glycosylation site)，Asn176和 Asn214;1個(gè)細(xì)胞黏附序列(cell attachment sequence)，Arg202-Asp204;1個(gè)糖胺聚糖黏附位點(diǎn)(glycosam inoglycan attachment site)，Ser455-Gly458;4個(gè)蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)(phosphorylation site);9個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位點(diǎn);10個(gè)N－連接酰基化位點(diǎn)(N-linked myristoylation site)。彭澤鯽GK氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物相比有極高的相似性，與建鯉(C.carpio var.Jian)、翹嘴紅鲌、虹鱒、金鯛、人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)和爪蟾(Xenopus laevis)的相似百分比分別為98.1%、95.4%、86.0%、85.7%、79.8%、79.1%和79.3%。

圖1 彭澤鯽G K基因全長(zhǎng)cDNA序列及其翻譯的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of GK gene full-length cDNA and the deduced am ino acid sequences in C.auratus var.Pengze

2.2 基于GK基因編碼氨基酸序列的聚類分析

基于7種魚類、11種內(nèi)溫動(dòng)物和1種兩棲類動(dòng)物GK基因編碼氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示:作為低等脊椎動(dòng)物，所有魚類聚為一枝，與高等動(dòng)物分開。在魚類，同屬鯉科的建鯉、彭澤鯽、翹嘴紅鲌、斑馬魚和草魚(Ctenopharyngodon idella)聚為一枝，自展支持率為100%，而同屬真骨魚類的虹鱒和金鯛聚為一枝。在內(nèi)溫動(dòng)物，同屬靈長(zhǎng)類的人、黑猩猩(Pan troglodytes)和獼猴(Macaca mulatta)聚為一枝，自展支持率99%，然后所有的哺乳動(dòng)物聚為一枝與鳥綱的家雞(Gallus gallus)分開，最后哺乳動(dòng)物和家雞等內(nèi)溫動(dòng)物聚為一枝，自展支持率99%，與兩棲類的爪蟾分開(圖2)。由GK氨基酸序列所反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類基本一致。

圖2 采用NJ法基于GK氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on glucokinase am ino acid sequences using NJmethod

2.3 彭澤鯽GK基因的組織表達(dá)

通過半定量RT-PCR方法對(duì)GK基因在大腦、白肌、脾臟、腸系膜脂肪和肝胰臟等組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖3所示。可知，GK基因主要在肝胰臟中表達(dá);同時(shí)，在脾臟、腸系膜脂肪和大腦中也檢測(cè)到微量表達(dá)，但GK基因表達(dá)量顯著低于肝胰臟(P＜0.05);白肌中沒有檢測(cè)到GK基因表達(dá)。而陰性對(duì)照組沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(結(jié)果未顯示)，表明沒有基因組DNA污染。

圖3 GK基因在彭澤鯽不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of GK mRNA in different tissues of C.auratus var.Pengze

3 討論

3.1 GK肽鏈與其他脊椎動(dòng)物比較

本研究采用RT-PCR和RACE方法從彭澤鯽肝胰臟中克隆了GK基因全長(zhǎng)cDNA序列，該cDNA編碼476個(gè)氨基酸。將彭澤鯽GK氨基酸序列與人、大鼠、爪蟾、建鯉、翹嘴紅鲌、虹鱒和金鯛等脊椎動(dòng)物的GK氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖4。

哺乳動(dòng)物GK分子量約50 ku，是己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型的1/2，只含1個(gè)結(jié)構(gòu)域，大鼠GK與腦己糖激酶Ⅰ型的C－端有75%的相似性［15］。己糖激酶基因家族催化葡萄糖生成G-6-P的ATP依賴型磷酸化反應(yīng)，是糖酵解途徑的限速酶，控制糖代謝的第1步反應(yīng)。與己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型不同，GK不受產(chǎn)物G-6-P的反饋抑制，因此，GK在肝細(xì)胞和胰島β細(xì)胞中作為葡萄糖傳感器和代謝發(fā)生器具有重要生理功能［2］。GK主要功能位點(diǎn)包括:ATP結(jié)合位點(diǎn)、葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)、N－連接糖基化位點(diǎn)等。大鼠GK氨基酸殘基Asp78-Lys90以及13個(gè)氨基酸之后的Lys102(大鼠氨基酸殘基編號(hào))對(duì)于與ATP結(jié)合非常重要［15］，包括彭澤鯽在內(nèi)的所有物種這一結(jié)構(gòu)域非常保守。在人類，GK氨基酸殘 基 Ser152-Pro154、Asn167-Lys170、Asn205-Thr207、Ile226-Asn232、Asn255-Gly259、Gln288及 Glu291(人氨基酸殘基編號(hào))被認(rèn)為是葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)，特別是葡萄糖的所有氧原子與GK氨基酸殘基Thr169、Lys170、Asn205、Asp206、Asn232、Glu257及 Glu291(人氨基酸殘基編號(hào))形成氫鍵［2，16］，上述氨基酸殘基在所有脊椎動(dòng)物中保守。

GK還含有1個(gè)保守的己糖激酶標(biāo)簽序列(Leu147-Phe162，人氨基酸殘基編號(hào))，在這些氨基酸殘基中，除了Ile159在鯉科魚類被Leu替代外，其他氨基酸殘基在所有脊椎動(dòng)物中基本保守。此外，所有脊椎動(dòng)物GK氨基酸序列中都具有保守的N－連接糖基化位點(diǎn)(Asn167和Asn205，人氨基酸殘基編號(hào));細(xì)胞黏附序列(Arg193-Asp195，人氨基酸殘基編號(hào))和糖胺聚糖黏附位點(diǎn)(Ser446-Gly449，人氨基酸殘基編號(hào))。爪蟾GK氨基酸殘基Glu51Glu52及His141-Leu144(爪蟾氨基酸殘基編號(hào))被認(rèn)為是調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)［16］，除 Glu51外，其他氨基酸殘基在所有物種中也保守。

3.2 GK基因的組織表達(dá)

哺乳動(dòng)物GK主要存在于肝和胰島β細(xì)胞，胰島素在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達(dá)。魚類肝胰臟GK基因僅在第1次喂食碳水化合物飼料后誘導(dǎo)表達(dá)，這與己糖激酶Ⅰ型基因從受精卵到胚后發(fā)育的各個(gè)階段均表達(dá)不同［17］;虹鱒GK基因僅在肝臟和下丘腦中表達(dá)，并受營(yíng)養(yǎng)條件調(diào)控，饑餓抑制GK基因表達(dá)，再攝食促進(jìn)GK基因表達(dá)，喂食后6 h GK基因表達(dá)出現(xiàn)高峰，說明肉食性虹鱒魚對(duì)飼料中碳水化合物利用率較低的原因不是肝臟缺乏可誘導(dǎo)的GK基因［18］。本研究結(jié)果表明，鯽魚GK基因主要在肝胰臟中表達(dá)，但脾臟、腸系膜脂肪和大腦中也檢測(cè)到微量表達(dá)，白肌中沒有檢測(cè)到GK基因的表達(dá)，這與虹鱒GK基因僅在肝臟和下丘腦中表達(dá)結(jié)果不同，因此，GK基因在魚類的組織表達(dá)還需進(jìn)一步研究。虹鱒肝臟GK活性及其基因水平隨飼料淀粉或葡萄糖的增加而提高［19－21］;肉食性的金鯛通過GK的調(diào)節(jié)，可忍受飼料中蛋白質(zhì)被碳水化合物部分代替［22－23］，饑餓降低金鯛肝GK基因表達(dá)水平，而飼喂高碳水化合物低蛋白質(zhì)飼料或用胰島素處理可促進(jìn) GK基因表達(dá)［7，24］。溫度升高也可促進(jìn)金鯛GK基因表達(dá)［25］。

圖4 彭澤鯽與人、大鼠、爪蟾、建鯉、翹嘴紅鲌、虹鱒和金鯛GK基因編碼氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Multiple alignment of the GK gene deduced am ino acid sequence from C.auratus var.Pengze w ith the corresponding sequences from Homo sapiens，Rattus norvegicus，Xenopus laevis，C.carpio Var.Jian，E.ilichaeformis，O.mykiss and S.aurata

4 結(jié)論

本研究從雜食性的成年鯽魚肝胰臟中克隆了GK基因全長(zhǎng)cDNA，其編碼氨基酸序列的主要功能位點(diǎn)(ATP結(jié)合位點(diǎn)、葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)、N－連接糖基化位點(diǎn)等)在硬骨魚類及其他脊椎動(dòng)物間高度保守，并證實(shí)了GK基因主要在彭澤鯽肝胰臟中表達(dá)，脾臟、腸系膜脂肪和大腦中微量表達(dá)，白肌中不表達(dá)。

［1］ KAWAIS，MUKAIT，MORIS，et al.Hypothesis:structures，evolution，and ancestor of glucose kinases in the hexokinase fam ily［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，99(4):320－330.

［2］ MAHALINGAM B，CUESTA-MUNOZ A，DAVIS E A，et al.Structuralmodel of human glucokinase in complex w ith glucose and ATP:implications for the mutants that cause hypo-and hyperglycem ia［J］.Diabetes，1999，48(9):1698－1705.

［3］ EGEA M，METON I，CORDOBA M，etal.Role of Sp1 and SREBP-1a in the insulin-mediated regulation of glucokinase transcription in the liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.General and Comparative Endocrinology，2008，155(2):359－367.

［4］ STOFFEL M，F(xiàn)ROGUEL P，TAKEDA J，etal.Human glucokinase gene:isolation， characterization，and identification of two m issensemutations linked to early-onset non-insulin-dependent(type 2)diabetes mellitus［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89(16):7698－7702.

［5］ HEMRE G I，MOMMSEN T P，KROGDAHL U.Carbohydrates in fish nutrition:effects on grow th，glucose metabolism and hepatic enzymes［J］.Aquaculture Nutrition，2002，8(3):175－194.

［6］ STONE D A J.Dietary carbohydrate utilization by fish［J］.Reviews in Fisheries Science，2003，11:337－370.

［7］ CASERASA，METON I，F(xiàn)ERNANDEZ F，etal.Glucokinase gene expression is nutritionally regulated in liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1493(1/2):135－141.

［8］ MOON TW.Glucose intolerance in teleost fish:fact or fiction?［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry ＆ Molecular Biology，2001，129(2/3):2－3.

［9］ 程漢良，夏德全，吳婷婷.魚類脂類代謝調(diào)控與脂肪肝［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，18(4):294 －298.

［10］ BLIN C，PANSERAT S，KAUSHIK S，etal.Partial molecular cloning and tissue distribution of hexokinaseⅠ cDNA in common carp［J］.Journal of Fish Biology，2000，56:1558－1561.

［11］ PANSERAT S，BLIN C，MEDALE F，et al.Molecular cloning，tissue distribution and sequence analysis of complete glucokinase cDNAs from gilthead seabream(Sparus aurata)，rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)and common carp(Cyprinus carpio)［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1474(1):61 －69.

［12］ 戈賢平，俞菊華，吳婷婷.翹嘴紅鮊GK基因的克隆和序列分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30(3):410 －415.

［13］ DIEFFENBACH CW，DVEKSLER G S.PCR primer:a laboratory manual［M］.Plainview，N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.

［14］ KUMAR S，TAMURA K，NEIM.MEGA3:integrated software formolecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5(2):150 －163.

［15］ ANDREONE T L，PRINTZ R L，PILKISS J，etal.The am ino acid sequence of rat liver glucokinase deduced from cloned cDNA［J］.The Journal of Biological Chem istry，1989，264(1):363－369.

［16］ VEIGA-DA-CUNHA M，COURTOIS S，M ICHEL A，et al.Am ino acid conservation in animal glucokinases.Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein［J］.The Journal of Biological Chemistry，1996，271(11):6292－6297.

［17］ PANSERAT S，F(xiàn)ONTAGNE S，BERGOT P，et al.Ontogenesis of hexokinaseⅠ and hexokinaseⅣ(glucokinase)gene expressions in common carp(Cyprinus carpio)related to diet［J］.The British Journal of Nutrition，2001，85(6):649－651.

［18］ SOENGAS JL，POLAKOF S，CHEN X，etal.Glucokinase and hexokinase expression and activities in rainbow trout tissues:changes w ith food deprivation and refeeding［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，2006，291(3):810－821.

［19］ PANSERAT S，CAPILLA E，GUTIERREZ J，et al.Glucokinase is highly induced and glucose-6-phosphatase poorly repressed in liver of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)by a single meal w ith glucose［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry ＆ Molecular Biology，2001，128(2):275－283.

［20］ CAPILLA E，MEDALE F，NAVARRO I，et al.Muscle insulin binding and plasma levels in relation to liver glucokinase activity，glucosemetabolism and dietary carbohydrates in rainbow trout［J］.Regulatory Peptides，2003，110(2):123－132.

［21］ PANSERAT S，MEDALE F，BLIN C，etal.Hepatic glucokinase is induced by dietary carbohydrates in rainbow trout，gilthead seabream，and common carp［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Com parative Physiology，2000，278(5):1164－1170.

［22］ METON I，CASERAS A，F(xiàn)ERNANDEZ F，et al.Molecular cloning of hepatic glucose-6-phosphatase catalytic subunit from gilthead sea bream(Sparus aurata):response of its mRNA levels and glucokinase expression to refeeding and diet com position［J］.Com parative Biochem istry and Physiology Part B:Biochem istry＆ M olecular Biology，2004，138(2):145－153.

［23］ FERNANDEZ F，M IQUEL A G，CORDOBA M，et al.Effects of diets w ith distinct protein-to-carbohydrate ratios on nutrient digestibility，grow th performance，body composition and liver intermediary enzyme activities in gilthead sea bream(Sparus aurata L.)fingerlings［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2007，343(1):1.

［24］ EGEA M，METON I，BAANANTE IV.Sp1 and Sp3 regulate glucokinase gene transcription in the liver of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.Journal of Molecular Endocrinology，2007，38(4):481 －492.

［25］ ENES P，PANSERAT S，KAUSHIK S，et al.Hepatic glucokinase and glucose-6-phosphatase responses to dietary glucose and starch in gilthead sea bream(Sparus aurata)juveniles reared at two temperatures［J］.Comparative Biochem istry and Physiology Part A:Molecular＆ Integrative Physiology，2008，149(1):80－86.