飼糧蛋白質水平對肥育豬肌肉嫩度及背最長肌鈣調磷酸酶－活化T細胞核因子信號途徑的影響

張 勇 陶 亮 崔 巖 朱宇旌 鄧 科 孫 璀 邵彩梅

(1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866;2.遼寧禾豐牧業股份有限公司，沈陽 110164)

保證肉品質是保障養殖業、肉類加工業、批發零售業效益及廣大消費者的切身利益的重要因素，對肉品質進行營養調控是當今動物營養領域研究的熱點之一。鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)、鈣調蛋白(calmodulin，CaM)和活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)共同構成了鈣調磷酸酶－活化T細胞核因子(CaNNFAT)信號途徑，這一途徑在調節骨骼肌生長，決定肌纖維類型特征中起著重要作用［1］。鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是內源性的，需要Ca2+信號來活化。它可以抑制肌肉內蛋白質降解，降低肌細胞生長速度;動物被屠宰后，它可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質水解［2］。CaN是受Ca2+信號活化的一種多功能信號酶，激活的CaN可以使NFAT的多個絲氨酸殘基去磷酸化，從而導致NFAT的構象發生變化，促使NFAT在細胞核內定位并使DNA結合功能域暴露，轉錄因子NFAT脫磷酸而活化而進入核內［3］。近年來，大部分的研究都集中在Ca2+-CaN-NFAT信號途徑在骨骼肌生長、發育及功能維持中的生物學功能［4－8］，有關 CAST作為肉質候選基因在研究牛、豬等哺乳動物中有所報道［9－12］，而飼糧蛋白質水平對CAST和CaN-NFAT信號途徑相關蛋白mRNA表達量的影響以及CaN-NFAT信號途徑與肌肉嫩度的關系都鮮有報道。本研究利用實時定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)方法，以β－肌動蛋白(β-actin)為內參，研究飼糧中不同蛋白質水平對CAST、CaN、NFAT和CaM mRNA在背最長肌相對表達量的影響，明確CAST與CaN-NFAT信號途徑在豬肌肉嫩度調控中的作用，為改善豬肉品質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

數顯式肌肉嫩度儀(C－LM 3型，東北農業大學工程學院研制);高速臺式冷凍離心機(TGL－20M，長沙湘儀離心機儀器有限公司);紫外分光光度計(Cary 50 Probe，美國Varian公司);基因擴增儀［TC－96/G/H(6)，杭州博日科技有限公司］;PCR儀(ABIPRISM 7000 HT Real-Time RCRSystem，美國ABI公司);凝膠成像系統(江蘇捷達)。

1.2 試驗試劑

RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)、RT-PCR試劑盒［SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)］、DEPC 水、DNA 分子量標準(DL2000)、50 bp DNA Ladder Marker均購自于TaKaRa公司;瓊脂糖購自于寶泰克(西班牙)公司;其他常用化學試劑均為國產分析純。

1.3 試驗動物與試驗設計

本試驗采用完全隨機區組試驗設計，選擇初始重約50 kg的杜洛克×長白×大白三元雜交豬90頭，隨機分配到3個處理，每個處理3個重復，每個重復10頭，公母各占1/2。3個處理分別采用12%、16%、20%理想蛋白質水平的飼糧，飼糧能量水平相同，正試期58 d，參照NRC(1998)肥育豬的營養需要配合成粉狀全價料，飼糧消化能保持相同。飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis) %

1.4 試驗設計與飼養管理

試驗前進行驅蟲、防疫、編號等工作。試驗豬水泥地面單圈飼養，自由采食，以鴨嘴式飲水器提供充足清潔飲水，日飼喂3次，清糞3次，保持舍內清潔，隨時觀察并記錄飼養期間豬的食欲、精神狀況、糞便等情況。

1.5 樣品采集

為了使胴體盡量少受破壞，肉樣采集位置為豬最后肋骨和最后腰椎間的單側背最長肌，采樣400 g，用于肉品質測定;并在最短的時間內于第13～16肋骨間取豬背最長肌樣本30 g，放入錫箔紙中包好，用液氮迅速冷凍，之后放于－80℃保存備用。

1.6 肌肉嫩度的測定

采用C－LM 3型數顯式肌肉嫩度儀測定肉樣剪切力，具體試驗方法參考張勇等［13－14］文獻。

1.7 RT-PCR法測定相關蛋白m RNA表達量

1.7.1 總 RNA 提取

參照RNA提取試劑盒推薦方法，提取豬背最長肌樣品總RNA。提取后的RNA用紫外分光光度計在260和280 nm處測定吸光度值，根據OD260nm/OD280nm檢驗純度，并按如下公式計算RNA的濃度:

1.7.2 cDNA 合成

按照RT-PCR試劑盒操作方法進行。cDNA合成后放－20℃保存備用。

1.7.3 引物設計與合成

β-actin、CaN、NFAT、CaM 和 CAST 的引物序列及參數見表2。引物均由上海生工有限公司合成。

1.7.4 RT-PCR

參照試劑盒操作說明，采用SYBR Green熒光染料法，在RT-PCR儀上進行相對定量分析。反應條件:94℃變性30 s，58～62℃退火30 s(具體基因的退火溫度見表2)，72℃延伸45 s，40個循環。

表2 引物序列及實時定量PCR反應條件Table 2 Primer sequences and the conditions for real-time PCR

1.7.5 相對表達量計算

目的基因相對表達量按以下公式計算:

目的基因相對表達量=2－△△Ct。

式中:Ct為閾值循環。

1.8 數據統計與分析

用中國科學院沈陽應用生態研究所的ABI Prism 7000 SDS software 1.5進行相對定量分析，PCR反應結束后自動生成報告，采用文獻中相對定量 2－△△Ct法［15］計算目的基因的相對表達量。用SPSS 16.0對數據進行統計分析，并用LSD法和Duncan氏法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 背最長肌剪切力及 CAST、CaN、CaM 和NFAT m RNA表達量

由表3可知，12%組肌肉剪切力顯著低于20%組(P＜0.05)，16%組與其他組差異不顯著(P＞0.05)，肌肉剪切力隨飼糧蛋白質水平升高而增加，即蛋白水平越高肌肉嫩度越差。20%組的CAST和CaN mRNA表達量極顯著高于12%組和16%組(P＜0.01)，12%組與16%組差異不顯著(P＞0.05)，CAST和 CaN mRNA在背最長肌中的表達量隨飼糧蛋白水平升高而增加;NFAT和CaM mRNA表達量在3個處理組間差異不顯著(P ＞0.05)。

表3 飼糧蛋白質水平對豬背最長肌剪切力、CaN、NFAT、CaM和CAST m RNA相對表達量的影響Table 3 Effects of dietary protein level on the shear force and mRNA relative expression levels of CaN，NFAT ，CaM and CAST of longissimus dorsi in finishing pigs

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同字母表示差異不顯著(P ＞0.05)。

In the same row，valuesw ith different small superscriptsmean significant difference(P ＜0.05)，and w ith different capital letter superscriptsmean significant difference(P ＜0.01)，while w ith the same letter superscriptsmean no significant difference(P ＞0.05).

2.2 背最長肌剪切力與 CaN、NFAT、CaM 和CAST m RNA表達量相關性

由表4可知，背最長肌剪切力與CAST mRNA表達量極顯著正相關(P＜0.01)，相關系數為0.713;背最長肌剪切力與 CaN、CAM 和 NFAT mRNA表達量的相關系數分別為0.439、0.135和0.374，無顯著相關(P ＞ 0.05)。CaN、CaM 與CAST mRNA表達量顯著正相關(P＜0.05)，相關系數分別為 0.594、0.596;NFAT 與 CAST mRNA表達量的相關系數為0.376，無顯著相關(P＞0.05)。NFAT、CaM 與CaN mRNA表達量顯著正相關(P ＜0.05)，相關系數分別為 0.536、0.546。CaM與NFAT mRNA表達量顯著正相關(P＜0.05)，相關系數為 0.623。

3 討論

3.1 飼糧蛋白質水平對背最長肌剪切力的影響

嫩度是肉品質的一種感官特征，也是其食用質量與商業價值的重要指標。它來源于肌束的結構和生化特性，特別是肌原纖維和中等細絲的結構和生化特性，以及肌間結締組織。肉的嫩化是尸僵發生后一定時間內，肌纖維碎裂、肌肉重新變軟、嫩度增加的過程［16］。肌肉嫩度的評定通常采用肉的咬力值和剪切力來表示。Goerl等［17］研究了飼糧蛋白質水平對28～104 kg豬肉品質的影響，同樣發現隨飼糧蛋白質水平的增加胴體背膘厚下降、瘦肉率增加、肉嫩度下降。Davey等［18］研究發現，用高蛋白質飼糧飼喂瘦肉型豬，可提高瘦肉率、降低肌肉內脂肪水平、降低肉的嫩度。張克英等［19］報道生長肥育豬60 kg后飼糧采用理想蛋白質水平12%，可獲得較好的豬肉品質，在此基礎上，適當降低飼糧蛋白質水平有利于改善豬肉的風味和嫩度，但進一步提高蛋白質水平，則可能影響豬肉品質，這與本試驗的結果相似，隨著飼糧蛋白質水平的升高，剪切力值上升，表明提高蛋白質水平對改善肌肉的嫩度有著負面影響。

3.2 飼糧蛋白質水平對背最長肌CAST和CaNNFAT信號途徑相關蛋白m RNA表達量的影響

鈣蛋白酶系統由一系列的鈣蛋白酶和CAST構成。鈣蛋白酶是肌原纖維蛋白質降解過程中的關鍵酶。CAST可抑制鈣蛋白酶的活性，當鈣蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有CAST存在，將迅速與之結合，影響其自溶穩定性，抑制鈣蛋白酶的活性，從而保證鈣蛋白酶只進行局部的特定位點的水解。Thomson等［20］報道，營養水平對斷奶閹公羊骨骼肌鈣蛋白系統活性均無影響，但肌肉蛋白質沉積速度與CAST活性呈正相關，肌肉蛋白質降解速度與鈣激活酶Ⅰ(μ-calpain)活性呈負相關。用不同蛋白質水平的飼糧飼喂56只狗，經過70 d后檢測得到CAST在狗的骨骼肌中表達量隨著蛋白質水平的提高而呈上升趨勢［21］。本試驗結果表明，飼糧蛋白質水平與背最長肌CAST mRNA表達量有一定的相關，隨著蛋白質水平的升高背最長肌CAST mRNA表達量增加，反映了蛋白質水平的提高可加快肥育豬的蛋白質沉積，從而抑制鈣蛋白酶對肌原纖維蛋白質的降解。這一結論與 Thomson 等［20］在羊的試驗報道和 Helman 等［21］在狗的試驗報道一致。

表4 豬背最長肌剪切力、CaN、NFAT、CaM和CAST m RNA相對表達量回歸方程Table 4 Regression equations of shear force and mRNA relative expression levels of CaN，NFAT，CaM and CAST of longissimus dorsi in finishing pigs

CaN-NFAT信號途徑是調節骨骼肌生長，決定肌纖維類型特征的主要信號途徑。本課題組曾研究了不同飼喂方式以及不同飼糧蛋白質水平對豬骨骼肌中CAST和鈣蛋白酶mRNA表達量的影響［13－14］，而就飼糧蛋白質水平對 CaN-NFAT 信號途徑相關蛋白mRNA表達量的影響國內外鮮有報道。本試驗中，隨飼糧蛋白質水平的升高豬背最長肌 CaN mRNA表達量顯著增加，NFAT、CaM mRNA表達量隨CaN mRNA表達量增加而增加，且三者之間的變化相關性明顯，其原因可能是當動物攝入蛋白質量增加，通過神經刺激使得胞質內 Ca2+濃度升高、CaN被激活，可以讓下游的NFAT家族成員脫磷酸并轉入細胞核，與細胞內轉錄因子結合，使得CaM表達增加。由于CAST在不同類型纖維中的表達是不同的［22］，CAST的表達與CaN-NFAT信號途徑的關系如何是一個值得研究的課題。但目前這方面的研究報道極少，本試驗的結果可為進一步研究CAST與CaN-NFAT信號途徑之間的調控機理提供參考。

3.3 背最長肌CAST和CaN-NFAT信號途徑對嫩度的影響

影響肉的嫩度的主要因素有肌節長度、結締組織含量及肌肉結構蛋白水解敏感性［23］。肉的嫩度是肌肉內部結構的反映，在一定程度上反映了肌原纖維、結締組織以及肌肉脂肪的含水量、分布和化學結構［24］。CAST對鈣蛋白酶具有抑制作用，其分解產物對鈣蛋白酶也具有抑制作用，而鈣蛋白酶對肌肉纖維具分解作用，因此理論上它可以作為嫩度的候選基因。Koohmaraie等［25］研究認為，高水平的CAST抑制宰后肌肉蛋白質水解和嫩化。孫立彬等［26］對125頭豬進行屠宰，通過CAST基因型與屠體性狀、肉質性狀的相關性分析，得出CAST基因對肌內脂肪含量具有顯著影響。武艷群等［27］試驗進一步證明CAST是與肉質相關性非常高的候選基因。本試驗結果同樣證實CAST與肌肉剪切力存在顯著相關性，CAST mRNA表達量的增加降低了豬背最長肌的嫩度。

隨著肉質研究的發展，人們開始關注肌纖維類型的特性及其分布規律，大量研究表明，肌纖維類型是決定肉品質的重要因素［28－30］。CaN-NFAT信號途徑是調節不同纖維類型基因表達的關鍵機制，小鼠CaN基因敲除模型證實CaN-NFAT信號途徑可激活骨骼肌慢縮型纖維的基因表達［31］。對CaN-NFAT信號途徑而言，Ca2+濃度持續增高比短暫脈沖式增高更重要［32］，這意味著在快縮纖維和慢縮纖維中，不同的Ca2+環境所誘發的CaNNFAT信號系統反應程度不同。CaN-NFAT信號通路被激活后，可以減輕肌營養不良鼠(mdx鼠)肌肉萎縮病變的程度［33］。CaN可以促進骨骼肌組織的再生。Sakuma等［34］研究發現，在大鼠的再生肌肉組織中，CaN活性及去磷酸化的NFAT含量均大幅度增加，得出Ca2+-CaN-NFAT信號途徑在肌肉的發生、發育及功能維持中非常重要。本試驗中，CaN、NFAT、CaM mRNA表達量均隨剪切力的升高而呈增加趨勢，說明CaN-NFAT信號途徑可能通過調節肌纖維的類型而在肌肉剪切力增高中起一定作用。對于CaN-NFAT信號途徑與肌肉嫩度的研究國內外鮮見報道，能否通過CaN-NFAT信號途徑相關蛋白的表達來進一步調控肉品質還有待進一步的研究。

4 結論

①飼糧高蛋白質水平顯著降低背最長肌嫩度、提高CAST和CaN mRNA表達量。

②背最長肌嫩度與CASTmRNA表達量正相關，CaN-NFAT信號途徑無相關性。

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