黑麥草酸性洗滌木質素/中性洗滌纖維、長度對山羊采食行為及瘤胃液pH和纖維素酶活性的影響

高 洋 徐 明 劉南南 趙向輝 劉嬋娟 姚軍虎

(西北農林科技大學，楊凌 712100)

粗飼料是反芻動物飼糧的主體，可為反芻動物提供最基本的能量和蛋白質等養分，同時飼糧中適宜的粗飼料含量可刺激咀嚼，增加唾液量，維持瘤胃液pH及乳脂穩定，使動物保持健康［1-2］。NRC(2001)［3］認為中性洗滌纖維(NDF)是表示纖維性飼料的最好指標。其中，粗飼料源中性洗滌纖維(forage NDF，FNDF)在維持動物機體健康方面起著決定性的作用［2-4］。Mertens［4］提出了物理有效中性洗滌纖維(physically effective NDF，peNDF)的概念，認為飼料NDF含量、牧草長度及韌性對動物健康有影響。NDF由纖維素、半纖維素和木質素構成，其中木質素在瘤胃中不能降解，但高含量木質素可增加飼料韌性，進而可能影響動物的采食行為以及瘤胃發酵。目前關于牧草長度、NDF含量對瘤胃健康的影響已有較多研究［4-5］，但有關NDF組分對山羊采食行為、瘤胃發酵特性等方面影響的研究則較少。本試驗選擇不同生長期的黑麥草，切割成不同長度作為粗飼料，研究黑麥草酸性洗滌木質素/中性洗滌纖維(ADL/NDF)、長度對山羊采食行為、瘤胃液pH和纖維素酶活性的影響，為評價黑麥草營養價值及其合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用初花期黑麥草(ryegrass at early-bloom stage，REB)和盛花期黑麥草(ryegrass at full-bloom stage，RFB)，分別切割成20 mm(93QS-218，廣東佳農)或粉碎成5 mm(9FQ-40A，廣州未來)理論長度，制備成4種粗飼料。4種粗飼料營養水平見表1。初花期黑麥草制成的粗飼料干物質(DM)、粗蛋白質(CP)、粗灰分和非纖維性碳水化合物(NFC)含量顯著較低(P ＜0.05)，NDF、酸性洗滌纖維(ADF)和 ADL含量顯著較高(P＜0.05)。黑麥草生長期、長度對DM和ADL存在交互作用(P ＜0.05)。

表1 4種粗飼料營養水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient levels of the four roughages(DM basis) %

1.2 試驗動物及試驗設計

選用4只體重(40.0±1.8)kg安裝有瘤胃瘺管的健康成年山羊，采用兩因素4×4拉丁方設計將試驗羊分為4個處理。根據FNDF相同設計粗飼料在飼糧中比例，設計4種試驗飼糧。因素1、2分別為飼糧中粗飼料 ADL/NDF(低、高)、長度(20、5 mm)。參照 NRC(2007)［6］推薦的干奶期奶山羊營養需要標準設計飼糧，營養水平滿足或超過40 kg干奶期奶山羊營養需要，試驗飼糧組成及營養水平見表2。

1.3 飼養管理

試驗羊單籠(0.75 m ×1.50 m)飼養，全天24 h光照，每天飼喂2次(08:00和20:00)混合飼糧，自由飲水。試驗每期20 d，其中預試期13 d，正試期7 d。每期試驗結束后直接進入下一期。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 粗飼料和飼糧長度分布

正試期收集各處理粗飼料和飼糧各50 g及全部剩料，測定長度分布［7］及營養水平［8］。長度分布用有 3 個篩層(19.00、8.00 和 1.18 mm)、1 個篩底的賓夕法尼亞篩測定，各篩層peNDF由相應的物理有效因子(physically effective factor，pef)乘以 NDF 含量獲得［2］。

1.4.2 采食量和采食行為

正試期每天記錄飼喂量、剩料量、采食量。記錄正試期干物質采食量(DM I)。

正試期第3～4天，在連續的24 h內以5 m in為間隔單位記錄采食、反芻和咀嚼時間。1次采食停止后，20 m in內不重新采食，認為采食停止;1次反芻停止后，5 m in內不重新反芻，認為反芻停止［11］;咀嚼時間為采食時間、反芻時間之和。

表2 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of trial diets(DM basis) %

擇食能力(sorting activity，SA)按以下公式計算:

式中:SAn為篩層n的擇食能力，n1為篩層n干物質采食量，n2為篩層n干物質預測采食量。

SAn等于100%代表沒有挑食，小于100%表示厭食，大于100%表示喜食［12］。

1.4.3 瘤胃液 pH

正試期的第1～2天，采用pH電極(IP-600-10，JENCO，美國)、pH 轉換器(691，JENCO，美國)和記錄儀連續監測山羊瘤胃液pH［9-10］，每5 m in測定1次，記錄每天 pH＜6.0及pH＜5.6的持續時間。

1.4.4 瘤胃液纖維素酶活

正試期第7天于08:00(飼喂前)、12:00、16:00、20:00(飼喂前)、24:00分別從瘤胃的前面腹部、尾端腹部、中間和前邊背部收集瘤胃內容物，準確稱取100 g放入帶封口的塑料袋，加100 m L磷酸緩沖液(pH 6.0，50 mmol/L)，雙手適度揉搓5 m in，使內容物與緩沖液充分混合，用2層紗布過濾，濾液分裝于3個10 m L離心管中，-80℃保存。

測量時，取出冷凍樣品室溫解凍，取20 m L立即在冰浴下進行超聲波細胞破碎處理(￠6 mm，400 W，處理30 s、間歇30 s，共 3 次)，所得細胞破碎液作為原酶液。采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定羧甲基纖維素酶、水楊苷酶、木聚糖酶和微晶纖維素酶的活性［13］。酶活單位(IU)的定義為每分鐘每毫升酶液作用于底物生成的還原糖量(μmol)。

1.5 數據分析

采用SPSS 17.0中的GLM模塊進行方差分析，Duncan氏法多重比較，以 P＜0.05作為差異顯著性判定標準，0.05≤P＜0.10時，認為存在顯著差異性的趨勢。

2 結果

2.1 粗飼料、飼糧長度分布和peNDF

由表2可見，黑麥草生長期不影響其制成粗飼料在各篩層的干物質分布和8.00、1.18 mm層的pef(P＞0.05)，但盛花期黑麥草制成粗飼料8.00、1.18 mm 層的peNDF顯著高于初花期(P＜0.05)。黑麥草長度對制成粗飼料在各篩層干物質分布有顯著影響(P＜0.05)，增加黑麥草長度，制成的粗飼料＞8.00 mm層上的干物質含量顯著提高(P＜0.05)，相應≤8.00 mm 層上的干物質含量顯著降低(P＜0.05);增加黑麥草長度，顯著提高了制成粗飼料 8.00、1.18 mm 層 pef和peNDF(P＜0.05)。黑麥草生長期、長度對制成粗飼料8.00 mm層peNDF存在交互作用(P＜0.05)。

表3 粗飼料長度分布和物理有效中性洗滌纖維(干物質基礎)Table 3 Particle sizes distribution and peNDF of the roughages(DM basis)

由表4可見，黑麥草ADL/NDF不影響飼糧的長度分布和pef、peNDF(P＞0.05)。增加黑麥草長度，可顯著增加飼糧＞8.00 mm層上的DM含量，相應顯著降低 ＞1.18～8.00 mm 層上的 DM含量(P ＜0.05)，顯著增加 8.00 mm 層 pef、peNDF(P ＜0.05)。

2.2 山羊采食量和采食行為

由表5可見，減小黑麥草長度可顯著提高山羊的DM I(P＜0.05)，顯著提高采食時間、顯著降低咀嚼和反芻時間(P＜0.05)。山羊喜食19.00、8.00 和 1.18 mm 層的飼糧(SA ＞100%)，厭食篩底層飼糧(SA＜100%)。飼糧高粗飼料 ADL/NDF顯著增加了山羊對飼糧19.00 mm層 SA(P＜0.05);減小粗飼料長度顯著增加了山羊對飼糧8.00 和1.18 mm 層的 SA(P ＜0.05)，降低了篩底層 SA(P ＜0.05)。

2.3 山羊瘤胃液pH

由表6可見，飼糧黑麥草ADL/NDF影響瘤胃液平均pH(P=0.05)，高ADL/NDF黑麥草提高山羊瘤胃液平均pH(P=0.05);pH＜6.0的持續時間顯著縮短(P＜0.05);不影響瘤胃液pH＜5.6的持續時間(P＞0.05)。增加黑麥草長度，顯著提高瘤胃液平均pH并顯著降低pH＜6.0的持續時間(P＜0.05)，有降低 pH ＜5.6的持續時間的趨勢(P＜0.10)。黑麥草ADL/NDF、長度對瘤胃液pH不存在交互作用(P＞0.05)。

2.4 山羊瘤胃液纖維素酶活性

由表7可見，高ADL/NDF黑麥草顯著提高山羊晨飼后12和16 h瘤胃液微晶纖維素酶、4 h水楊苷酶和8 h木聚糖酶的活性(P＜0.05)。增加黑麥草長度，顯著提高了山羊晨飼后8和16 h的瘤胃液微晶纖維素酶、8 h羥甲基纖維素酶和4 h的水楊苷酶的活性，但降低了晨飼后16 h的羥甲基纖維素酶活性(P＜0.05)。黑麥草ADL/NDF、 長度對各種酶活性不存在交互作用(P＞0.05)。

表4 飼糧長度分布和物理有效中性洗滌纖維(干物質基礎)Table 4 Particle sizes distribution and peNDF of the diets(DM basis)

表5 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊干物質采食量和采食行為的影響Table 5 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on DM Iand eating behavior of goats

各組4種纖維素酶活隨時間變化趨勢一致，均為先降低后升高。微晶纖維素酶、羥甲基纖維素酶與水楊苷酶的活性均在晨飼后4 h降到最低，而達到最高值的時間不一致。

表6 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊瘤胃液pH的影響Table 6 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on rum inal pH in goats

表7 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊瘤胃液纖維素酶活的影響Table 7 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on rum inal cellulase activities in goats

3 討論

3.1 不同生長期、長度黑麥草制成粗飼料和飼糧的長度分布

Mertens［4］認為飼料 peNDF 與長度和 NDF 含量成正比，Yang 等［14］與David 等［15］的研究也證明了以上觀點。Beauchem in等［16］通過3次切短處理，得到長、中、短3個長度的玉米青貯，利用賓夕法尼亞篩確定其 pef分別為 0.84、0.73和 0.67，peNDF含量分別為 11.5%、10.3% 和 8.9%。本試驗中，黑麥草長度對飼糧8.00 mm層 pef及peNDF的影響與上述研究一致，但黑麥草長度對飼糧1.18 mm層pef和peNDF影響不顯著，主要是因為本試驗的長度處理使飼料較多在滯留在19 .00 和8.00 mm 層。

3.2 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊采食量和采食行為的影響

奶牛的DM I及采食行為受粗飼料長度、粗飼料種類、精飼料營養水平和管理實踐等因素的影響［17-18］。Maulfair等［19］報道，當奶牛飼糧中依次含有 1.5%、6.5% 、8.6% 和 11.7% 的 ＞ 26.9 mm的長度時，每天的DM I線性降低。Kononoff等［20］研究也證明了降低飼料長度，DM I增加。本研究與上述報道一致。Kononoff等［7］認為這是因為減小飼料長度，縮短了在瘤胃滯留時間，從而降低了瘤胃飽和度。關于粗飼料ADL/NDF對DM I影響的研究較少，構成NDF的各組分在瘤胃中的降解特性不同，因此NDF組成可能會通過影響飼糧在瘤胃中的消化率和滯留時間進而影響DM I，但本研究中未觀察到以上現象。Teimouri等［21］研究顯示，增加苜蓿干草長度，極顯著提高反芻和咀嚼時間，顯著提高采食時間。曾銀等［22］也發現，隨苜蓿干草長度增加，奶牛采食、反芻和咀嚼時間均顯著增加。本研究與以上研究一致。但Yang等［2］研究顯示，苜蓿青貯長度對奶牛采食、反芻和咀嚼時間影響不顯著。Hosseinkhani等［23］發現增加泌乳前期奶牛采食的干草長度，顯著增加反芻和咀嚼時間，而對采食時間沒有影響。造成以上差異的原因可能是不同研究中采用的粗飼料種類的長度不同所致。動物采食充足且營養平衡的飼糧是維持健康和獲得最佳生產效益的基礎，但研究顯示泌乳奶牛實際攝取的飼糧與設計飼糧不完全相同［24］。在本試驗中采用的2種長度的粗飼料，山羊喜食的20 mm的粗飼料，這與趙向輝等［10］關于苜蓿草對山羊的報道一致，而與Hosseinkhani等［25］對奶牛的研究結果不一致，主要原因可能是2種動物的采食習性不同。而同一篩層飼糧中，山羊喜食5 mm黑麥草組飼糧，具體原因有待進一步探討。

3.3 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊瘤胃液pH的影響

Krehbiel等［26］認為瘤胃液 pH 低于 6.0 時，動物處于亞急性瘤胃酸中毒(subacute rum inal acidosis，SARA)，Keunen 等［27］將 pH 5.6 作為瘤胃是否處于SARA的界限。保持奶牛飼糧適宜的長度，可維持瘤胃內環境健康，防止發生 SARA［28］。Yansari等［29］用 含 有 長 度 為 7.83、4.04 和1.14 mm苜蓿干草的3種飼糧飼喂9頭泌乳中期的荷斯坦奶牛，結果顯示瘤胃液pH隨長度的增加而增加。本試驗中增加黑麥草長度，顯著增加瘤胃平均pH和降低pH＜6.0的持續時間，與上述研究結果一致。Boon等［30］認為飼糧中部分成分不能被瘤胃消化，是由于植物生長后期的木質化，木質素使微生物產生的酶很難接觸到細胞，降低細胞的降解性。本試驗顯示ADL/NDF顯著影響瘤胃液pH，采食高ADL/NDF飼糧能更好的維持瘤胃液pH，這可能是因為高木質素含量抑制瘤胃發酵所致;同時，較高木質素含量改變了飼糧韌性，因此可能會通過促進咀嚼增加唾液產量，從而對瘤胃液pH具有一定的緩沖作用。

3.4 飼糧黑麥草ADL/NDF、長度對山羊瘤胃液纖維素酶活性的影響

纖維素在瘤胃內降解主要是通過纖維分解菌分泌的多酶復合體來實現的。瘤胃液中的微晶纖維素酶、羥甲基纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶是分解飼糧碳水化合物的主要酶種［31］。Zebeli等［32］體外研究顯示，隨著牧草長度的減小，瘤胃內纖維酶活性顯著增高。本試驗發現大部分時間段微晶纖維素酶、羥甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶活性隨黑麥草長度增大而增大，與以上研究不符，這可能是由以下2方面原因引起的:1)瘤胃液pH，瘤胃液pH對瘤胃發酵有重要的作用，當pH＜6.0時瘤胃中水解纖維素的pH敏感菌會受到抑制［33］。馮仰廉等［34］報道纖維素分解菌對瘤胃液pH的變化敏感，發酵纖維物質的瘤胃微生物在 pH 為6.2～6.8時活性最高，當 pH ＜6.2時其生長繁殖就會受到抑制，使纖維菌分解纖維能力下降，導致反芻動物對粗飼料的消化率降低。本試驗中隨黑麥草長度增大瘤胃液平均pH顯著提高，pH＜6.0的持續時間顯著降低，進而瘤胃液纖維素酶活性得到了提高。Zebeli等［32］認為體外研究與體內研究存在差異。24 h內瘤胃液pH隨時間劇烈的波動［16］，不同pH變化幅度對酶活影響不同，這導致了本試驗中酶活在部分時間差異顯著的現象。2)植物細胞壁的結構可能對瘤胃微生物與植物組織的接觸具有決定性作用［35］。木質素作為物理屏障，阻止酶穿透細胞壁和近距離作用于細胞內容物［36］。可見，飼料中木質素含量增高，飼料在瘤胃中的發酵性降低。本試驗中高ADL/NDF黑麥草顯著提高了部分時間段的微晶纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶的活性，這可能是因為此3種酶對pH較為敏感;含低ADL/NDF黑麥草飼糧在瘤胃中發酵程度較高、瘤胃液pH較低(表6)，酶活受到抑制。

4 結論

①增加黑麥草長度，顯著提高飼糧＞8.00 mm層上的 DM 含量及 8.00 mm 層 pef、peNDF，顯著降低山羊的DM I及采食時間、顯著增加咀嚼和反芻時間。

② 增加黑麥草ADL/NDF、長度均使山羊瘤胃液平均pH提高，pH＜6.0的持續時間顯著縮短，部分采食后部分時間點纖維素酶活性提高。

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