非共生固氮菌株BC2接種冰草的研究

鄭紅麗,樊明壽,龐保平

(內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

早在1888年,Berthelot發現未消毒土壤會有氮素的贏余,而消毒土壤卻沒有，他推斷是土壤中自由生長的微生物起了作用，而且這種作用可以彌補土壤的氮素損失[1]。之后100多年中，人類不僅認識了當年Berthelot描述的自生固氮的原理， 而且做了大量菌種分離和接種試驗。1926年，Kostychev等[2]報道了接種固氮菌對煙草生長以及土壤氮素積累的正面效應后，俄羅斯對這個菌種進行了幾十年的大量推廣。但Mishustin[3]認為俄羅斯的田間試驗只有1/3有效。其他類似研究結果也不完全一致，如在水稻(Oryzasativa)上接種固氮菌可以使單季稻固定20～100 kg/hm2氮素，而有的卻無效果[4-7]。盡管目前國內不同研究小組在玉米(Zeamays)、水稻和小麥(Triticumaestivum)等不同作物上的接種試驗都得到了正面效應[8-10]，但非共生固氮菌接菌劑沒有廣泛推廣的現實說明非共生固氮菌的接種應用還存在一些困難。究其原因，土著菌的競爭、碳源不足等環境因素是影響固氮菌固氮潛力發揮的重要因子。冰草(Aqropyromcristatum)是內蒙古天然草原及栽培草地的主要草種，本研究選擇從內蒙古天然草原上冰草根際分離獲得的固氮活性較高的菌株BC2進行室內接種試驗，以觀察其對冰草生長的氮素營養貢獻及其受土著菌和碳源的影響，為進一步開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 菌株BC2于2006年從內蒙古錫林郭勒天然草原上冰草根際土壤分離獲得，通過乙炔還原測定，其固定乙烯量為3.38×10-7μmol/cfu，適宜生長pH值7～9，可耐2%的鹽濃度，在LB液體培養基培養18 h后進入生長對數期；經16S rDNA和Biolog鑒定，BC2 為少動鞘氨醇假單胞菌(Sphingomonassangulinis)[11]。

土壤取自內蒙古錫林郭勒天然草原，全氮含量0.42 g/kg，速效磷16.4 mg/kg，速效鉀含量104 mg/kg，有機質含量1.5%，土壤pH值8.1，土壤為栗沙土，質地以中細沙為主，屬于典型草原土壤[12]。

1.2方法

1.2.1土著菌對BC2接種效果的影響 將20粒冰草種子用0.15%的升汞溶液消毒后，用無菌水沖洗，然后種植于裝有1.0 kg 土壤(干質量)的花盆內，共12盆，其中6盆土壤經170 ℃、4 h高溫滅菌。待出苗15 d，取6盆植株(其中3盆土壤經過滅菌， 3盆未滅菌)，將50 mL生長處于對數期的菌懸液(108～109cfu/mL)接種于冰草根際，另外6盆加入等量滅活的培養液作為對照，形成具有3次重復的處理組合。室內培養80 d，收獲冰草，植株和土壤烘干后，測定植株含氮量和土壤的全氮量，然后計算整個體系的固氮量(ΔN1)。

ΔN1=(收獲時接種植株總氮量-收獲時未接種植株總氮量)+(收獲時接種土壤總氮量-收獲時未接種土壤總氮量)。

1.2.2碳源對BC2接種效果的影響 取6盆(3盆土壤滅菌，3盆未滅菌)土壤分別加入10 g蔗糖，另外6盆(3盆土壤滅菌，3盆未滅菌)不加蔗糖作為相應對照。植物栽培、管理方式同1.2.1。待出苗15 d，12盆植株中分別接入50 mL處于生長對數期的菌懸液(108～109cfu/mL)，形成具有3次重復的處理組合。室內培養80 d，收獲冰草，測定植株含氮量和土壤的全氮量，然后計算整個體系的氮素盈虧ΔN2[13]。

ΔN2=(收獲時加蔗糖植株總氮量-收獲時未加蔗糖植株總氮量)+(收獲時加蔗糖土壤總氮量-收獲時未加蔗糖土壤總氮量)。

1.2.3全氮含量 土壤全氮采用半微量凱氏定氮法[14]，植株全氮采用H2SO4-H2O2消煮-奈氏比色法[13]。

1.3數據分析 統計分析采用SAS軟件進行獨立樣本的t測驗。

2 結果與分析

2.1土著菌對BC2固氮效果的影響 各個處理條件下，土壤含氮量均有所下降，土壤滅菌后接種BC2處理組合在收獲時土壤含氮量最高，為0.41 g/kg，也低于試驗開始前的水平(表1)，這主要是冰草生長消耗導致的。在土壤不滅菌的情況下，接種固氮菌的植株干質量比未接種的處理高5.8%，土壤滅菌后，接種處理的植株干質量比未接種的高6.8%， 說明接種對促進冰草生長有一定作用。無論土壤滅菌與否，接種BC2后植物吸收的總氮量、土壤總氮量和體系總氮量均顯著高于未接種處理(P<0.05)(表1)。如果僅從植株生物量的增加幅度來比較，土壤滅菌條件下的接種效應與土壤不滅菌的無顯著差異(P>0.05)。但在土壤不滅菌的情況下，接種固氮菌的植株總氮量比未接種的處理高8.7%，而土壤滅菌后，接種處理的植株總氮量比未接種的高12.5%。若比較土壤和植物的總氮量相加得到的體系總氮量，土壤滅菌的效果更加明顯。在土壤不滅菌的情況下，接種固氮菌使體系總氮量增加42.55 mg/kg，而在土壤滅菌后，接種處理使體系總氮量增加80.95 mg/kg，是未滅菌處理的近2倍。

2.2增加碳源對BC2固氮效果的影響 在土壤不滅菌的前提下接種固氮菌，加蔗糖與不加蔗糖處理間的聯合體系總氮量、植株吸收的總氮量及土壤總氮量均無顯著差異(P>0.05)(表2)。若供試土壤經過滅菌，情況則不同，在加蔗糖與不加蔗糖處理間土壤總氮量以及植物吸收的總氮量均存在顯著差異(P<0.05)。加蔗糖處理整個植株和土壤體系的總氮量比不加蔗糖處理高31.03 mg/kg。

表1 土壤滅菌對固氮菌BC2接種效果的影響

表2 增加碳源對固氮菌接種效果的影響

3 討論

土壤是一個動態、有生命的自然體，是微生物良好的培養基，同時微生物也是土壤的重要組成部分，在草原生態系統的物質和能量轉化中占有重要地位，是維持草原生態平衡的參與者[15-16]。在土壤中，很多種微生物雜居在一起。土壤中存在大量種類和數量不同的土著菌，它們能有效地利用有限的碳源在競爭中處于優勢地位。即使對于共生固氮作用的根瘤菌而言，雖不直接在土壤中與其他微生物爭奪營養而是侵入植物體獲得能量，但大量研究表明根瘤菌的接種也受土著菌的影響[17]。因此，非共生固氮菌的接種必然存在土著菌的競爭和影響。在這種情況下，明確固氮菌的競爭能力非常必要。本研究充分表明，在內蒙古錫林郭勒草原土壤中存在著與BC2 菌株即少動鞘氨醇假單胞菌競爭的土著菌，因為經土壤滅菌處理后接種，其效果明顯好于未滅菌處理。但是，未經滅菌處理的土壤接種固氮菌BC2 也使整個體系的總氮量顯著增加， 意味著菌株BC2也具有一定的競爭能力；研究還表明，增加碳源于土壤對提高BC2的固氮效率有顯著作用。本研究供試土壤的有機質含量為1.5%，屬于瘠薄土壤，許多草地的土壤有機質含量低于該值，意味著碳源更加缺乏。因此，增加土壤有機質的措施必將會直接和間接地增加土壤含氮量。

內蒙古錫林林郭勒草原土壤中廣泛分布有非共生固氮菌，它們是草地氮素的重要來源。因此，挖掘草地非共生固氮菌的潛力，摸清影響固氮菌固氮能力的環境因子亦是草地氮素營養的重要研究內容，對指導生產實踐具有重要理論意義。

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