水產養殖環境常見四環素類抗生素抗性基因tet(M)的演化及傳播的初步分析

陳琳琳,劉維青,劉 靜,張高生,任宗明

(1.中國科學院 煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003; 2.黃島出入境檢驗檢疫局,山東 青島 266555;3.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071)

自20世紀中后期,發達國家即開始對環境中抗生素的含量及可能的生態效應高度關注,并相繼建立了不同環境介質中的抗生素濃度標準[1]。而中國相關方面的研究起步較晚,但隨著臨床醫學中抗生素使用劑量的不斷增大及耐藥性的出現,國內學者也開始越來越關注抗生素的環境污染與生態毒性效應[2-5]。抗生素的長期使用會造成生態環境中耐藥性細菌及抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)的產生[6]。ARGs在生物體中可能長久而持續地傳播,即使攜帶ARGs的細胞被殺滅或消亡,它釋放到環境中的DNA仍可能通過垂直傳播或水平轉移轉染給同屬或不同屬的其他細菌,進而在環境中傳播、擴散,從而對公共健康和食品衛生、飲用水安全等構成威脅[7-8]。眾多國內外學者認為ARGs在環境中的持續性殘留、菌群間的遷移、轉化和傳播,比抗生素殘留本身對生態環境的危害更大[9-10]。針對這些問題,Pruden等[11]2006年首次提出將抗生素抗性基因作為一類新型環境污染物。

四環素類抗生素由于其廣譜性和低毒性,廣泛應用于醫藥衛生、畜牧業、農業以及養殖業。而近幾年,四環素耐藥細菌及抗性基因的不斷發現成為多個領域面臨的嚴重問題[12]。細菌對四環素類的抗性主要由兩種機制介導：一種是能量依賴性排出泵(energy dependent efflux pump),另一種是核糖體保護蛋白(ribosomal protection proteins,RPPs)[13]。目前已經發現了40多種四環素抗性基因,兩種機制的抗性基因大多可以通過可轉移的質粒或轉座子傳播,進而滲透到各種需氧或厭氧的革蘭氏陽性和陰性細菌中[14]。其中RPPs基因廣泛分布于地球多種環境介質中,并且它們與生物蛋白質合成過程中起重要作用的延長因子,如EF-G(原核生物蛋白質合成過程中催化 tRNA的移位和多肽延伸的每個循環后期mRNA從核糖體上掉下來)/EF-2(參與真核生物蛋白質合成,功能相當于原核生物的EF-G)以及EF-Tu(介導氨酰-tRNA進入核糖體的空位)/EF-1α(真核生物EF-1的α亞基,相當于原核生物中的EF-Tu亞基)具有近緣關系[15-17]。通常抗性基因作為“附件”基因單位(“accessory” genes),一般位于質粒、轉座子等可動遺傳因子上,他們與細菌自然環境下的成長并沒有必然的聯系,而延長因子是細菌生長所必需的基因,并且來自具有很長進化歷史的參與蛋白合成的GTPase家族[18]。鑒于 RPPs基因與延長因子的特殊關系,對RPPs基因本質的研究是了解該類抗性基因的抗藥性機制和傳播途徑的非常有效且直接的方法。

本研究關注的tet(M)基因就是一類重要的 RPPs基因,它通常和接合性轉座子Tn1545-Tn916相結合,而Tn1545-Tn916是一個廣宿主轉座子,它可以在多種細菌之間轉移[14,19-20]。這使得tet(M)基因可以通過染色體垂直傳播或質粒、轉座子水平傳播進而在環境中廣泛傳播。研究顯示,tet(M)基因在水產養殖環境中分布廣泛,很有可能迅速在環境中造成抗性基因污染[21]。國外學者對不同環境介質不同細菌寄主的tet(M) 基因進行了研究,試圖從分子水平分析tet(M)基因的起源[22-25]。根據我們掌握的文獻,目前國內尚無單獨對tet(M)基因的研究報道,只有從不同環境介質檢測到tet(M)基因的存在[26]。為了研究不同來源的tet(M)基因與其環境介質、細菌宿主的相關性,從DNA序列這一最本質的層面揭示抗生素抗性基因的分化及潛在的傳播機制,本文采用分子系統學的方法針對水產養殖環境中常見的四環素類抗生素抗性基因tet(M)的序列特點及系統發育進行分析,旨在為今后分析抗生素抗性基因來源、污染機理及控制對策奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 養殖環境tet(M)基因數據獲取

從GenBank下載來自不同水產養殖生物和養殖環境的常見四環素類抗性基因tet(M)序列,基本信息包括抗性基因種類、細菌種屬、環境介質及序列接受號Accession number列于表1。

表1 水產養殖環境檢出的tet(M)基因Tab.1 Detection of tet(M) genes in aquaculture environment

1.2 序列比對與系統學分析

將 20條序列用 Clustal W 軟件[32]比對,DnaSP 4.0[33](DNA sequence Polymorphism)軟件進行單倍型及多態性分析。采用MEGA 4.0[34](molecular evolution genetic analysis)軟件,用最大簡約信息(Most Parsimony,MP)法和鄰近(Neibourgh Joining)法構建系統發育樹。再應用自展法(bootstrap)檢驗樹的可靠性(500次重復)。空位始終作為缺失狀態,大腸桿菌延長因子EF-Tu基因(Gi| 296507628：5254-6438)作為外源基因,并結合寄主細菌分類及環境介質與tet(M)基因的系統發育作相關性分析。

2 結果與分析

2.1 序列多態性分析

序列比對得到662 bp同源片段,55個多態位點。20條基因序列有 4種基因型(表 2),其中基因型tet(M)-a存在于來自澳大利亞養殖魚體內分離的3種細菌,包括嗜水氣單胞菌兩個亞種及遲鈍愛德華菌Edwardsiella tarda; b基因型廣泛分布于多種細菌中,包括 B1、C1、C2、D1、E2、E4、E6、E7、F2、F3、F4 、B2共5種環境介質12種細菌,其中B1、C1、C2、D1、E2等5種細菌均來自弧菌屬(Vibrio); c基因型只存在于1種鏈球菌中,且與d基因型具有很近的親緣關系,僅在405bp位點上有一個單堿基的A/G轉換; d基因型存在于4種細菌,包括2種芽孢桿菌F1、E5,一種弧菌E1,以及一種希瓦氏菌E3。4種基因型的平均核苷酸差異度為4.2%,最大值8.3%出現在b和c兩種基因型之間,最小值在c和d之間,為0.2%。

表2 tet(M)基因型核苷酸差異度及多態位點Tab.2 Nucleotide divergence and polymorphic sites in different tet(M) genotypes

2.2 系統發育分析

最大簡約樹顯示20條tet(M)序列清晰分成三大分支(圖 1),其中 Clade1對應于tet(M)-a基因型,Clade2對應于tet(M)-c和 d基因型,Clade3對應于tet(M)-b,500次重復檢驗,枝上置信度均為100%。鄰近法構建的系統樹與此樹形結構相同,文中未列出。

圖1 水產養殖環境tet(M)基因分子系統發育樹(分支上數字為自展支持率)Fig.1 Molecular phylogenetic tree of tet(M) genes in Aquaculture environment (The numbers above the branches indicate bootstrap support of MP)

3 討論

從表1可以看出,水產養殖環境中tet(M)基因存在于多種細菌中,從海水環境中常見的病原菌到一些環境細菌。有研究表明,日本東京海域 21%～96%四環素抗性細菌攜帶有tet(M)基因,越南湄公河養殖區及中國海洋生物養殖場也檢測到大量的tet(M)基因,暗示tet(M)基因是養殖環境細菌四環素抗性的主要機制[25,29,35]。tet(M)基因存在于細菌的可動遺傳元件如質粒、轉座子、接合轉座子以及整合子[14,22,36],這使得tet(M)基因能更容易從一個物種傳播到另一個物種[37],進而導致其在環境中大量細菌內的廣泛分布[15]。在中國,長期以來四環素類抗生素因其廣譜及低毒性,一直作為水產養殖的常用藥,并作為添加劑低劑量加入餌料以促進養殖生物的生長,使得養殖環境成為四環素類抗生素的重要潴留池。因此,tet(M)基因的環境毒理效應,應作為中國養殖環境重要的關注對象。

基因序列多態性分析顯示(表2),20條水產養殖環境中tet(M)基因共有4種基因型,其中,tet(M)-a基因型僅存于從澳大利亞養殖魚體分離的3種細菌中,其他3種基因型在各種介質中均有出現,暗示著a基因型具有一定的環境介質特異性。相同的環境介質代表著相同或近似的抗生素使用背景。研究發現抗生素抗性基因與抗生素的使用背景有著直接的關系,抗生素對耐藥菌株抗性基因的誘導具有專一性,因此,理論上抗生素本身在環境中的遷移、轉化及歸趨等環境行為與其所誘導的抗生素抗性基因,在環境中的傳播應該具有很大的相似性和一致性,抗生素的使用歷史與其抗性基因之間存在相關性[38-39]。日本科學家對太西洋遠洋海域的抗性基因研究發現,在大洋深處未被抗生素污染的區域,仍然檢測到了tet(M)抗性基因的存在[40]; Neela等[41]研究發現,有些革蘭氏陽性菌雖然攜帶tet(M)基因,但仍對四環素敏感,說明tet(M)抗性基因的檢出頻率并不代表著抗性水平,還需要從基因表達的角度去分析。本研究中,大多數tet(M)的基因型與環境介質并無直接關系,相同或相近的環境介質內,tet(M)基因型可能相同或近緣(如A1、A2與A3),但也可能遠緣(如D1與D2,F1與F2),說明環境介質與tet(M)基因型并無嚴格的相關性,暗示著tet(M)基因在環境中的迅速傳播及分化。根據前人報道,很多抗生素抗性基因其實在抗生素使用之前就已存在,Kobayashi等[42]的分子系統學研究結果更加證實了RPPs基因包括tet(M),早在地球上生物總界分化之前已經存在,也就是說,RPPs在原核與真核生物分化之前就已經開始進化。從寄主細菌的分類地位角度看,水產養殖環境中 4種基因型在細菌中分布沒有嚴格的種屬特異性(表2)。相同或相近的tet(M)基因型可以存在于近緣或相同的細菌中(如弧菌屬的5種細菌均攜帶tet(M)-b基因型),也可以存在于遠緣的物種(如tet(M)-d同時存在于芽孢桿菌F1、E5,弧菌E1以及希瓦氏菌E33類細菌中)。同種或近緣的細菌應該具有相同或類似的遺傳背景,而本研究中相同的遺傳背景包含不同的tet(M)等位基因或者相同的tet(M)在遠源的細菌株系中發現,進一步顯示了tet(M)基因活躍的運動和進化[23]。

系統發育樹上 20條基因序列分成了三大分支(圖 1),其中 Clade1對應于tet(M)-a基因型,Clade2對應于tet(M)-c和d基因型,Clade3對應于tet(M)-b基因型。Rahman等[25]對日本近岸海域細菌抗性的研究,將海洋環境的tet(M)基因分成兩種類型：tet(M)-A和tet(M)-B,其中前者代表起源于前抗生素時代即存在的自然基因儲備(natural gene pool); 后者則代表通過選擇或水平基因轉移獲得的基因。三大支系中,Clade2包含的tet(M)-d基因型與tet(M)-A相同,clade3對應的tet(M)-b則與tetM-B型相同,二者的平均核苷酸差異度達到8%; 這兩種基因型與前人研究結果相比,分別對應于Agerso等[43]2006年所分的tet(M)-II和tet(M)-III,Gevers等[24]2003年所分的tet(M)-2和tet(M)-1,以及Huys等[44]2004年所分的type-I和type-V。Clade1對應的tet(M)-a及Clade2中的tet(M)-c與tet(M)-d近緣,但已有一定的分化,核苷酸差異度分別為3.7%和0.2%。Oggioni研究顯示,tet(M)的基因變異是由于兩種遠緣的等位基因的同源重組產生的,這兩種遠緣等位基因類型分別發現于Tn1545和Staphylococcus aureus[45]。新的tet(M)基因型可能是由于前兩種等位基因重組形成的鑲嵌結構(mosaic structure),進而形成了介于兩類遠緣等位基因之間的基因型[23,24,46]。由此本研究中,tet(M)-a與tet(M)-c應為tet(M)-b和tet(M)-d兩種遠緣基因型的中間類型。

綜上所述,tet(M)基因的分型與細菌的分類及環境介質的來源并無嚴格的相關性,因此今后在研究此類基因的環境毒理效應時,不應只分析基因的檢出率及抗生素背景,還應從分子水平研究基因的變異及表達在不同細菌寄主及環境介質中的變化,了解該類基因的抗性分化機制,以期從分子手段入手降低甚至消除其抗藥性或阻斷其傳播途徑。中國作為水產養殖大國,在生產過程中抗生素特別是四環素類抗生素濫用嚴重,抗藥細菌及抗生素抗性基因的增多將大大增加養殖業及人體耐藥病原菌病害發生和流行的可能性及危害程度。tet(M)基因是水產養殖環境中的優勢抗性基因,傳播及進化活躍,廣泛分布于多種耐藥性病原菌及環境細菌中,因此,在今后的科研及環境保護過程中應予以一定的重視。

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