中藥提取液對雞傳支病毒的效果研究

張素輝，曹國文，陳春林，邱進杰

（重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460）

為了觀察項目組研制的三個中藥組方對預防和治療雞傳染性支氣管炎的安全性和有效性，本試驗采用IBV-M41標準株感染雞胚，觀察其作用效果，為臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 中藥提取液 依據麻杏石甘散進行組方加減，

得到三個中藥組方。采用蒸餾法和水提醇沉法提取，并經10000r/min高速離心取上清液制得。

1.1.2 種毒 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV-M41株），購自中國獸藥監察所。

1.1.3 實驗雞胚 9日齡SPF雞胚，購自山東濟南某家禽科技有限公司。

1.1.4 試劑及儀器 試劑包括生理鹽水、10 000IU/mL雙抗等。儀器包括孵化箱、高壓滅菌鍋、離心機、無菌操作臺、水浴鍋。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒復壯 IBV-M41株使用前用雞胚復壯，種毒按1∶1000稀釋，經尿囊腔接種于9日齡SPF雞胚，每胚0.1mL。37℃培養72h，收集雞胚尿囊液，加入10%10000IU/mL雙抗混勻，以2000r/min離心15min，取上清作為病毒感染液備用。

1.2.2 IBV-M41毒株雞胚半數感染量（EID50）的測定 將IBV-M41毒株用生理鹽水按10倍系列連續稀釋成8個稀釋度，取105至108稀釋梯度的稀釋液接種于9日齡雞胚尿囊腔，每個稀釋度接種5枚雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，另設4枚雞胚為空白對照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，每間隔10h照蛋，記錄死胚數和有典型病變的雞胚數，7d內死亡的隨時取出放于4℃冰箱中保存，24h內死亡的胚不計。按Reed-Muench方法計算EID50。

1.2.3 試驗設計及分組 將140枚9日齡SPF雞胚統一在孵化箱中孵化，分別按以下方法分組并處理：

中藥提取液安全性測定組：將三個組方的中藥提取液用生理鹽水分別作100倍稀釋后再作連續2倍比稀釋，取連續5個稀釋度的稀釋液接種9日齡雞胚，每個稀釋度接種3枚雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，另設2枚雞胚為空白對照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察3 d，每天觀察雞胚發育情況，記錄死胚情況。最后根據存活雞胚數判定中藥對雞胚的毒性，找到無毒性最大濃度，該濃度即為對雞胚的最大安全濃度。

中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力阻斷作用的測定組：將最大安全濃度的中藥提取液0.1mL接種于9日齡雞胚，將雞胚置于37.5℃孵化箱中作用，分別于2、4、8、16、24h后取出，再將含有200×EID50的病毒液按0.1mL/枚接種于雞胚。每種方法接種3枚雞胚，另設3枚雞胚作空白對照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經10h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察7d，每天觀察雞胚發育情況，記錄死胚情況。

中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力抑制作用的測定組：將含有200×EID50的病毒液0.1 mL接種于9日齡雞胚，將雞胚置于37.5℃孵化箱中保溫，2、4、8、16、24 h后取出，再將最大安全濃度的中藥液按0.1 mL/枚接種于雞胚。每種方法接種3枚雞胚，另設3枚雞胚作空白對照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經10h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察7d，每天觀察雞胚發育情況，記錄死胚情況。

2 試驗結果

從病毒復壯試驗中發現，雞胚接種病毒后36 h，雞胚發育開始減緩，第3 d出現雞胚死亡，死亡高峰出現在第5、6 d，7 d后雞胚死亡率達70%。雞胚主要表現發育遲滯，胚體矮小，羊膜增厚，卵黃囊縮小，尿囊液增多。

2.1 IBV-M41毒株EID50的測定結果 IBV-M41毒株EID50為0.2mL 10-6.58倍稀釋的病毒液，雞胚整體發育不良，胚體小，畸形。空白對照組全部存活。

2.2 中藥提取液安全性測定結果 由表1可知，在同一個稀釋梯度：組方1與組方2、組方3相比，其安全性較好，在100×20倍稀釋度時對雞胚發育影響不明顯，毒性不大；組方2在100×23倍稀釋度時對雞胚發育無影響，100×20至100×22倍稀釋度時對雞胚發育有致畸作用；組方3在100×20倍稀釋度時對雞胚發育有影響，與對照胚比較，胚體萎縮，個別頭部有出血，胚體發育小。

表1 中藥提取液安全性測定結果

2.3 中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力阻斷作用的測定結果 由表2可知，組方1對IBV-M41株的阻斷效果較好，其最佳作用時間為4～16h階段。

表2 中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力的阻斷作用

2.4 中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力抑制作用的測定結果 由表3可知，組方1對IBV-M41株的抑制作用較好，其最佳作用時間為2～8h階段。

表3 中藥提取液在雞胚水平上對病毒毒力的抑制作用

3 討論

3.1 用IBV-M41感染SPF雞胚，7 d致死率達70%，其病變和致死率與文獻報道的基本一致，表明人工感染造模成功。

3.2 從試驗數據可以看出，組方1提取液能顯著阻斷和抑制IBV-M41對SPF雞胚的毒害作用，從而有效地保護雞胚免受侵害。在對病毒毒力阻斷作用進行測定的試驗中，先注入中藥提取液再在不同時段接種IBV-M41，三個組方中，均為16 h和24 h階段的死亡率較高，說明該組方在37.5℃的雞胚中藥效代謝較快，在經過16 h后，對IBV-M41株作用減弱；在2、4 h和8 h試驗階段，只有組方1沒有死亡雞胚出現，其他均有不同程度的死亡和弱胚，說明組方1對IBV的阻斷效果較好。在對病毒毒力抑制作用進行測定的試驗中，先接種IBV再在不同時段注入中藥提取液時，三個組方中，均為16 h和24 h階段的死亡率較高，說明病毒在37.5℃的雞胚中經過16～24 h孵化后，病毒量達到較高滴度致雞胚死亡；在2、4 h和8 h試驗階段，只有組方1沒有死亡雞胚出現，其他均有不同程度的死亡和弱胚，說明組方1對IBV的抑制效果較好。

3.3 由試驗結果可見，本實驗室設計的三個中藥組方提取液在雞胚中對IBV的阻斷和抑制試驗取得了較滿意的結果，以組方1效果最為明顯，其中尤以對病毒的阻斷作用極佳。其作用機理可能為：中藥與雞胚作用后，中藥提取液提高了雞胚的免疫力，有效阻止了病毒的吸附和侵入。而中藥組方對病毒的抑制作用試驗中，病毒侵染雞胚后再添加中藥，中藥樣品對雞胚內的病毒起一定的抑制作用，抑制了病毒的生物合成及成熟釋放。其具體作用機理有待于進一步探明。

3.4 麻杏石甘散中，麻黃具有宣通肺氣以平喘，杏仁降氣化痰以平喘止咳，二藥相合增強了清肺化痰、止咳平喘的作用。石膏清泄肺熱，甘草有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調和諸藥等功能。麻杏石甘湯方劑對目前生產中常發的呼吸道疾病有明顯的治療作用，也有抗病毒和抑菌作用。陳玥等研究發現，麻杏石甘提取物對哮喘大鼠有抑制體重減輕，延長引喘潛伏期，恢復機體的白細胞數目及正常分布，降低血及肺組織中ET-1含量，改善肺部支氣管組織病理形態學結構等作用。本試驗對配方進行加減，并對其提取液的功效加以比較，為雞傳染性支氣管炎等病毒性疾病的治療和預防提供了基礎資料。

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