甘孜州牦牛沙門氏菌的分離和鑒定

董映輝，張朝輝，毛全富，岳 華，余 勁，李 勁

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州動物疫病預防控制中心，四川 康定 626000；3.四川省爐霍縣動物疫病預防控制中心，四川 爐霍 626500）

2010年6月，四川省甘孜州爐霍縣12戶牧民的100多頭成年牦牛發病，根據流行病學情況、臨床癥狀、病理解剖學變化情況初步診斷為沙門氏菌病，隨即進行實驗室鑒定，現將診斷情況報告如下：

1 概況與診斷方法

1.1 發病情況 四川省甘孜州爐霍縣12戶牧民的1 300頭成年牦牛，2010年5月11日開始發病，發病一周左右出現死亡，平均每天死亡1～2頭，截至6月2日送檢，發病100余頭，死亡30余頭。發病牦牛精神沉郁，食欲廢絕，跪臥，呼吸困難，體溫升高至41.5℃，有輕微神經癥狀，鼻腔有膿性分泌物，便秘后腹瀉，糞中帶有腸黏膜和血。隨病程發展病牛消瘦，眼窩下陷，皮膚彈性降低，后期臥地不起，四肢末梢發涼，一周后衰竭而死。

1.2 剖解變化 發病牦牛主要的剖解變化為心包積液；肝脾臟腫大；肺臟水腫出血；真胃出血，胃內有未消化的白色凝乳塊；腎結石，表面有出血點；小腸黏膜脫落，有出血點；大腸出血等。

1.3 實驗室檢驗

1.3.1 病料涂片鏡檢 采取病死牦牛的心、血、肝臟和脾臟觸片，瑞氏染色，鏡檢。

1.3.2 細菌的分離培養 無菌采取病死牦牛的心臟、肝、脾、腎臟，接種在營養豐富的TSA瓊脂平板培養基中，經37℃培養24h，革蘭氏染色，顯微鏡觀察。

1.3.3 鑒別培養 采上述組織器官病料培養的典型菌落，接種在SS培養基中，經37℃培養24h后觀察。再將SS培養基中長出的典型菌落接種到伊紅、美蘭、血液瓊脂培養基和肉湯培養基中，經37℃培養24 h后觀察。

1.3.4 生化實驗 從TSA瓊脂平板培養基中挑選出具有代表性的菌落10株（編號為S1～S10），分別接種于微量發酵管中，置于37℃溫箱中培養2～3d，每天觀察反應情況。

1.3.5 血清學鑒定 采用玻片凝集法進行血清型鑒定。在玻片上用少量生理鹽水稀釋普通營養瓊脂平板上的純化菌落，用微量加樣器吸取沙門氏菌A-F多價標準診斷血清與之混合均勻，然后觀察。

1.3.6 16SrRNA的擴增、測序及系統發育分析 將分離得到的細菌接種于普通營養肉湯中，于37℃振蕩培養24h，取培養液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細菌基因組DNA，用Peter等設計的針對革蘭氏陰性菌16SrRNA基因引物進行16SrRNA擴增，引物信息見表1。擴增片段經膠回收試劑盒純化后與PMD18-T載體連接，轉化DH5α工程菌進行目的片段克隆，經酶切鑒定，菌液PCR鑒定為陽性克隆后再送大連寶生物公司測序。

1.3.7 動物實驗 將純化的分離菌接種于普通營養肉湯，置37℃搖床培養18h。菌液用比濁法記數，將菌液稀釋至5×108cfu/mL，腹腔注射小鼠5只，每只0.2mL，對照組5只小鼠腹腔注射滅菌普通肉湯（0.2mL/只）。接毒后的小鼠隔離飼養，觀察其發病及死亡情況。死亡的小鼠立即剖檢，無菌采取肺臟、肝臟、心血涂片、革蘭氏染色、鏡檢，并在營養瓊脂平板上劃線分離培養，同時觀察病理學變化。

2 結果

2.1 病料觸片觀察結果 病料觸片經瑞氏染色，可從鏡檢中觀察到無芽孢、無莢膜，兩極淡染的中等大小桿菌。

2.2 細菌分離、鑒別培養的結果 在營養豐富的TSA培養基上37℃培養18h便長出了明顯的菌落，經觀察沿接種線處生長出圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明的中等大小菌落，不同器官中分離到的菌落形態基本一致，各器官分離到的典型菌落經革蘭氏染色鏡檢，結果均為革蘭氏陰性小桿菌，與直接涂片的菌體形態相同。在SS鑒別培養基中，經37℃ 24h培養觀察，生長出半透明、灰白色、呈圓珠狀、能溶解膽鹽并有光澤的小菌落；菌落的邊緣色澤淺，中心色澤深，并稍突起。在伊紅、美蘭、血液瓊脂培養基和肉湯培養基中，經37℃ 24h培養觀察，伊紅、美蘭培養基上的菌落呈露珠狀、粉紅色、邊緣整齊；血液瓊脂平板上的菌落為灰色圓珠狀，邊緣整齊、中間稍突起，不溶血；肉湯培養基呈均勻混濁，管底部有凝集，呈陽性反應。這些特征都與沙門氏菌的培養特性相符。

表1 引物信息

2.3 生化實驗結果 分離菌株在三糖鐵瓊脂中產酸，斜面變紅，底層反應呈陽性并產生硫化氫（H2S）；乳糖、麥芽糖、蔗糖均為陰性反應，對甘露醇和葡萄糖均為產酸產氣；枸櫞酸鹽和MR試驗為陽性反應；VP試驗和靛基質反應均為陰性。10株菌均符合雞沙門氏菌的生化特性。

2.4 血清型鑒定 將分離到的10個菌株分別與沙門氏菌A-F多價血清進行玻片凝集試驗，結果發現這10個菌株均發生凝集反應，進一步用因子血清與10個分離菌株進行凝集反應，結果發現10個分離菌株均與06、08因子發生凝集，其中06為2株，08為8株。

2.5 16SrRNA PCR擴增、測序及同源比對分析結果

2.5.1 16SrRNA PCR擴增結果和克隆質粒酶切鑒定結果 16SrRNA PCR擴增產物在約1 386 bp處出現一條明亮的條帶，克隆質粒酶切片段大小也在1386 bp處，與預期大小一致，見圖1。

圖1 分離菌的16SrRNA的PCR擴增及酶切鑒定結果

2.5.2 測序及同源比對分析結果 經16SrDNA序列測定，擴增序列長度為1386bp，用Genbank中Blast工具與Genbank序列進行同源比對，結果顯示分離菌只與沙門氏菌屬中的腸道沙門氏菌種腸道沙門氏菌亞種具有同源性，同源性最高達99%。

2.6 動物實驗結果 接種小鼠于感染后8 h開始死亡，16h全部死亡。解剖死亡小鼠可見肺部出血，肝、脾腫大出血，腸脹氣，并從死亡小鼠的全部內臟器官中分離到感染菌，對照組小鼠未見異常。

3 小結

根據12戶牧民牛群的發病情況、臨床表現、剖解變化情況，綜合實驗室鏡檢結果、分離培養結果、16SrRNA測序比對結果以及動物實驗結果，確診該病是由沙門氏菌屬腸道沙門氏菌種腸道沙門氏菌亞種引起的牦牛沙門氏菌病。

牦牛是草原上重要的經濟動物，牦牛沙門氏菌病不僅給牧民造成了嚴重的經濟損失，而且被污染的牦牛產品還可能嚴重危害人類的健康，因此應加強該病在草原上的防控。

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