丙酮丁醇梭菌中丁醇脫氫酶的分離純化及酶學性質研究

孫 超，謝達平

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

隨著全球化石能源的日益枯竭和環境污染的惡化，生物丁醇作為一種生物能源和重要化工原料以其新型、潔凈、可再生等特點開始受到人們的高度重視[1]。就傳統的丙酮丁醇發酵而言，依然存在著菌種耐受有機溶劑能力低、丁醇產量、產率低等缺點[2]。針對傳統丙酮丁醇發酵中存在以上問題，以發酵菌種的改良為主要目的，采用分子生物學手段、基因工程及代謝工程來提高丁醇的產量已成為研究的熱點。

丙酮丁醇發酵的主要菌種是丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是一種革蘭氏陽性、細胞呈梭狀、能產生丙酮、丁醇和乙醇(3∶6∶1，w/w)溶劑的厭氧芽孢桿菌。丙酮丁醇梭菌細胞代謝過程中，通過解除代謝過程中各種可能的中間產物的抑制，調控強化各種關鍵酶，如丁醛脫氫酶（BAD）、乙酰乙酸脫羧酶（AADC）、乙酰乙酰-CoA：乙酸/丁酸∶CoA 轉移酶（CoAT）、丁醇脫氫酶（BDH）等，對加強丁醇的合成代謝，提高丁醇的產量具有重要的意義[3-4]。其中丁醇脫氫酶BDH（EC 1.1.99.8）作為丁醇代謝途徑中的關鍵酶之一，直接影響到最終產物丁醇產量的高低。丁醇脫氫酶是一種誘導酶，在產溶劑階段酶活力達到最高[5]，其分子量為82±2 kDa，由兩個分子量都為42 kDa的同工酶（Ⅰ和Ⅱ）組成，其中BDHⅠ作用于丁醇合成初期，BDHⅡ作用于丁醇濃度較高的時期，根據對輔酶的依賴性可分為依賴NADH的BDH和依賴NADPH的BDH[6-9]，該菌株中依賴NADH的BDH在國內未見報道，為此，本文研究了丙酮丁醇梭菌發酵過程中依賴NADH的BDH的分離純化，旨在為丙酮丁醇梭菌代謝途徑的調控提供一定的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）保存，菌種編號1.0133。

1.1.2 試劑及儀器 供試試劑為NADH，L-半胱氨酸，正丁醛，硫酸銨等。儀器為超聲波破碎儀，紫外分光光度計，冷凍離心機，恒溫培養箱，冷凍干燥機等。

1.1.3 培養基 （1）活化培養基：玉米粉2%，蛋白胨0.05%，葡萄糖0.2%，L-半胱氨酸0.05%，硫代乙醇酸鈉0.02%。過40目篩的玉米粉需煮沸60min，pH調至6.8，分裝于厭氧管中，裝液量5 mL,于121℃滅菌20min。（2）種子培養液：葡萄糖4%，牛肉膏0.2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.6%，乙酸銨0.3%，K2HPO40.05%，MgSO40.02%，FeSO40.001%，pH調至6.5，分裝于帶硅膠塞的厭氧瓶中，裝液量60mL,于 121℃滅菌 20min。（3）發酵培養基：同種子培養液，分裝于厭氧瓶中，裝液量150 mL，于121℃滅菌20min。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化與發酵培養 從保存的丙酮丁醇梭菌斜面上挑取一環細菌接種于新鮮的活化培養基中，35℃培養48 h。從已經產生氣體的活化培養基中吸取0.5 mL菌液接種于種子培養液，35℃靜置培養24 h，再取種子培養液以5%的接種量接種于發酵培養基中，35℃靜置培養48 h。

1.2.2 丁醇脫氫酶粗酶液的制備 細胞培養約48 h，檢測是否有代謝產物的產生，若有則置于冰浴中停止培養，5 000 r/min，4℃，離心10min收集細胞。蒸餾水洗滌2次，測定細胞濕重，并以1:3的比例用 0.1 mol/L Tris-HCl（含 0.1mmol/L DTT）pH 7.5的緩沖液使細胞重懸。細胞重懸液置于冰浴中，超聲波細胞破碎儀破碎細胞，功率20W，10 min,間歇10 s。細胞破碎液經 10 000 r/min，4℃，離心 10min，所得上清液即為粗酶液，4℃備用[10]。

1.2.3 丁醇脫氫酶酶活測定 對細胞粗酶液測定BDH酶活可通過（1）式進行反應換算：

通過測定NADH在340 nm下的降低量從而測定丁醇脫氫酶酶活。反應體系為：3mL 0.01mol/L Tris-HCl，pH 6.0緩沖液中含2 mmol/L丁醛，0.5 mmol/LNADH及50μL酶液[11]。加入丁醛之前，含有酶液的反應體系先于35℃水浴中平衡30min，然后補加適當的NADH，再加入底物丁醛，35℃反應10 min，迅速置于冰浴中5min,終止反應，在340 nm下比色，計算NADH在340 nm下讀數的降低值，空白對照用等體積的去離子水替代底物丁醛[12]。酶活力單位定義：每1min NADH的OD值下降0.001為1個酶活力單位[13]。

1.2.4 蛋白質濃度的測定 用考馬斯亮藍結合法測定蛋白質的質量濃度[14]。

1.2.5 丁醇脫氫酶的分離純化 將研細的（NH4）2SO4按照20%的飽和度加入到粗酶液中，4℃下靜置1 h，再在10 000 r/min下離心30min，棄去沉淀（沉淀為初步分離的雜蛋白），取上清液加硫酸銨至60%飽和度，4℃下靜置1 h后10 000 r/min下離心30 min，棄去上清液，沉淀用10 mmol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液溶解[15]。取上述酶液2mL，以0.5mL/min的流速進行Sephadex G-75凝膠層析，分部收集洗脫液，每管收集4 mL，在280 nm下測定各管OD值，并測定各部分活性[16]。

1.2.6 丁醇脫氫酶的SDS-PAGE分析 將經過硫酸銨沉淀及Sephadex G-75凝膠層析后具有酶活的酶液進行SDS-PAGE電泳檢測[17-18]。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果及分析

丁醇脫氫酶純化結果如表1所示。結果表明經過2次硫酸銨沉淀，硫酸銨飽和度為60%，可除去部分非蛋白質雜質，酶比活力由20.21 U/mg提高到33.14 U/mg，純化倍數為1.64。再經過Sephadex G-75凝膠層析進一步純化，通過分子篩作用酶比活力提高到256.7 U/mg，純化倍數為12.7。

表1 丙酮丁醇梭菌中丁醇脫氫酶的純化

2.2 Sephadex G-75柱色譜洗脫曲線

將收集到的洗脫液分別測定280 nm下的蛋白濃度和具有蛋白峰管數的酶活，其結果如圖1。結果表明蛋白濃度在第12，16和23管分別出現三個峰，其中第16管峰值最大，而具有丁醇脫氫酶活性的出現在第18～20管，將其冷凍干燥保存備用，作為電泳鑒定分析。

圖1 Sephadex G-75凝膠層析曲線圖

2.3 SDS-PAGE電泳鑒定分析

將每步純化收集的具有酶活的組分進行SDSPAGE，結果見圖2。在42.0 kDa附近出現了一條帶，與報道的目的蛋白結果相符。

圖2 SDS-PAGE電泳分析丁醇脫氫酶

2.4 丁醇脫氫酶酶學性質研究

2.4.1 粗酶液中丁醇脫氫酶的穩定性 按照1.2.3方法在有氧狀態下每24 h測定粗酶液中丁醇脫氫酶的活力，觀察保存于4℃下丁醇脫氫酶的穩定性，結果如圖3。丁醇脫氫酶在10 d后其活力下降至初始活力的30%。

圖3 丁醇脫氫酶的穩定性

2.4.2 丁醇脫氫酶的最適反應溫度 按照1.2.3中的方法，分別取 20、25、30、35、40、45、50℃下測定其酶活，結果見圖4。由圖4可以看出在35℃下丁醇脫氫酶的活力達到最高值，其最適反應溫度為35℃。

圖4 溫度對丁醇脫氫酶的影響

2.4.3 丁醇脫氫酶的最適反應pH值 按照1.2.3中的方法，在35℃下，將緩沖液的pH值分別調制4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 并測定其酶活，結果見圖5。由圖5可以看出丁醇脫氫酶在pH為6.0的時候達到最高值，但是酶受pH的影響并不顯著。

圖5 pH值對丁醇脫氫酶的影響

3 結 論

本實驗從丙酮丁醇梭菌中分離純化了依賴NADH的丁醇脫氫酶，經過硫酸銨沉淀和Sephadex G-75凝膠層析，酶比活力達到256.7 U/mg，純化倍數為12.7，回收率為28.9%，丁醇脫氫酶在有氧狀態下保存10 d酶活力為初始酶活的30%，其最適反應溫度是35℃，最適反應pH是6.0。由于細胞內有關丁醇代謝途徑的關鍵酶含量不高，且易氧化失活，胞外反應體系構建中其它酶和天然底物與NADH存在耦聯反應，給酶活測定造成一定的難度。本文將丁醇脫氫酶酶活測定方法進行適當改良從而避免其它酶和天然底物對實驗結果所帶來的影響。

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