雞飼料中非淀粉多糖體外發酵特性評價的比較研究

易中華 朱年華 黎觀紅 宋小珍 潘 珂 瞿明仁

采用體外發酵技術評價日糧纖維的營養價值（Tilley等，1963），在反芻動物營養學上已經有40多年的歷史。Ehle等（1982）將這項試驗技術應用到人體大腸微生物體外發酵膳食纖維上。體外發酵法具有如下優點：發酵條件一致、發酵時間一致、能夠準確測定發酵產物的產量、試驗費用低廉。體外發酵試驗一直存在爭議的是，使用糞樣作為發酵菌源得出的結果能否代表腸道內微生物利用纖維的能力。Sunvold等（1995a、b、c、d） 結合體內腸道對日糧纖維的發酵，用豬、貓、狗、馬、牛、人等的新鮮糞樣作為發酵菌源，系統研究了甜菜渣、果膠、瓜爾膠、纖維素等幾種日糧纖維的發酵特點，結果發現，以新鮮糞樣作為體外發酵的菌源，有機物質消失率的測定值與體內試驗測定值具有很好的相關性。Vickers等（2001）用狗盲腸菌源，比較了菊粉、果寡糖和幾種日糧纖維的體外發酵特點，結果表明，菊粉和果寡糖的發酵性很高，甜菜渣、甘露寡糖和大豆纖維具有中等程度的發酵性，纖維素的發酵性最低。但上述試驗的日糧纖維成分中還含有很多蛋白質等非纖維類成分，這勢必對發酵結果造成干擾。

本試驗的目的是采用飼喂無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸菌源，通過體外發酵玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素，比較其短鏈脂肪酸的產量及產生速率，為評價不同飼料中非淀粉多糖（NSP）的體外發酵特性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及菌源

選用48只1日齡AA肉公雞，隨機分成6個籠，每籠8只雞。試驗日糧參照NRC（1994）家禽營養需要量標準，配制為玉米-大豆濃縮蛋白型日糧，不含任何抗生素，以粉料形式飼喂。試驗雞籠養，自由采食和飲水，飼養管理和免疫程序參照AA肉仔雞飼養手冊進行。試驗第42 d 8:00從每籠中隨機抓取2只試雞，肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉后，將試雞宰殺，剖開腹腔，取出盲腸，結扎固定盲腸近端，自結扎外側剪斷，用硫酸紙包扎，置于液氮中，然后轉移至-80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.2 非淀粉多糖的來源及制備

非淀粉多糖來源于濾紙纖維及玉米、豆粕、小麥和麥麩等4種飼料原料。以濾紙纖維作為純纖維素的來源。參照Choct等（1992）的方法，從玉米、豆粕、小麥和麥麩等飼料原料中提取堿溶性NSP。

①將1 kg欲提取NSP的飼料樣品粉碎（過60目篩），溶解在10 L熱水中，加入α－淀粉酶1.5 ml置于80～100℃的水浴槽中培養1 h，以降解飼料樣品中的淀粉。

②冷卻后，加入5 g胰蛋白酶（Sigma公司）于50℃的水浴槽中培養1 h，以除去飼料樣品中的蛋白質。

③培養后以1000×g轉速離心30 min。

④去除上清液，將殘留物加入等體積的0.2 M氫氧化鈉溶液，于80℃的水浴槽中培養2 h。

⑤利用0.2 M醋酸調整至pH值為7，并以1000×g轉速離心30 min。

⑥除去上清液后，再加入4倍體積的80%（v/v）乙醇溶液混和，再以13000×g轉速離心30 min。

⑦取出沉淀物后，轉移至60℃干燥箱中干燥，即可得到NSP。

1.3 發酵程序與樣品采集

1.3.1 培養液的配置

培養液的配方參照Sunvold等(1995)的方法配置。

表1 培養液的配方

1.3.2 發酵底物處理

稱取0.3 g底物（準確至0.001 g），放入250 ml葡萄糖瓶中，加入30ml培養液，于121℃高壓滅菌20min。每種發酵底物按一式三份處理，設為3個重復。

1.3.3 菌源的處理

采用SPSS15.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，組內比較采用單因素方差分析，組間比較采用成組t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

將取回來的盲腸食糜樣品在超凈臺室溫解凍，用預先配置好的培養液以1：10（重量與體積之比）的比例稀釋混勻后，用200目尼龍網過濾，取濾液，將濾液密封于250 ml葡萄糖瓶中，沖入CO2使其保持在厭氧環境中。

1.3.4 菌源對底物的發酵

向每個裝有底物的葡萄糖瓶中加入1 ml處理好的菌源，沖入CO2，密封，放入37℃恒溫搖床中培養6、12、24 h。在各個時間點取上清液樣4 ml，用于測定發酵液的SCFA產量和pH值。

1.4 測試指標及方法

1.4.1 飼料原料的纖維成分分析

參照Lee等(1992)的酶分解比重法，分析玉米、豆粕、小麥和麥麩等4種飼料原料及其NSP提取物所含的總日糧纖維（TDF）、可溶性日糧纖維（SDF）與不可溶性日糧纖維（IDF）的含量。采用張麗英（2003）的方法，測定4種飼料原料及其NSP提取物的干物質（DM）、粗纖維（CF）和粗蛋白質（CP）的含量。

1.4.2 發酵液中短鏈脂肪酸濃度的測定

參照Carre等（1995）的方法，用Hewelett Packard 6890型氣相色譜儀測定腸道內容物中乙酸、丙酸和丁酸的濃度。取上清液1 ml于塑料安培管中，加入1 ml的25%偏磷酸溶液，蓋緊蓋子，振蕩搖勻，并置冰水浴中30 min；25000×g離心20 min，取上清液，上機測樣。上機氣相色譜條件見儀器說明書。

1.5 數據處理

原始數據經Excel初步處理后，采用SPSS 16.0軟件中的One－Way ANOVY程序進行方差分析和Duncan's法多重比較。試驗結果用平均數±標準差（X±S）表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的纖維成分分析

玉米、小麥、豆粕和麥麩等4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的日糧纖維組成見表2。在飼料原料組成中，總日糧纖維或粗纖維的含量均以小麥麩為最高，總日糧纖維含量以玉米為最低，粗纖維含量以小麥為最低，且所有原料粗纖維的含量均遠低于總日糧纖維的分析值；在總日糧纖維的比例中，可溶性纖維所占比例以小麥（22.07%）為最高，豆粕（20.37%）次之，小麥麩（12.16%）最低。按Choct等(1992)的方法提取玉米、小麥、豆粕和麥麩中NSP，其提取量分別為8.37%、16.48%、36.14%、50.53%均高于飼料原料中總日糧纖維的分析值。在堿溶性NSP提取物組成中，除豆粕NSP提取物粗蛋白含量高達15.45%外，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低；總日糧纖維含量大幅度高于原料，且不同NSP提取物之間總日糧纖維含量的差距變小；可溶性纖維占總日糧纖維的比例仍以小麥NSP為最高，豆粕NSP次之，小麥麩NSP最低。

表2 飼料原料的日糧纖維與其堿溶性非淀粉多糖提取物的組成（%，風干基礎）

2.2 非淀粉多糖體外發酵后短鏈脂肪酸產量和組成比例的比較

表3為肉仔雞盲腸食糜菌源體外發酵玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素在6、12、24 h后短鏈脂肪酸（SCFA）產量及組成比例。小麥NSP提取物的SCFA產量及生成速率最大；豆粕NSP提取物次之，第6、12、24 h的SCFA總產量分別為小麥NSP提取物的65.38%、65.07%、71.76%；玉米NSP提取物和小麥麩NSP提取物緊隨豆粕NSP提取物之后，第6、12、24 h的SCFA總產量分別為小麥NSP提取物的 61.53%、57.53%、62.75%和 55.77%、44.52%、45.10%；纖維素的可發酵性最差，第12、24 h的SCFA總產量僅為小麥NSP提取物的10.96%～14.90%。總之，5種NSP的可發酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。

此外，上述NSP發酵產物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發酵時間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數發酵底物在第24 h產生丁酸的比例明顯增多。

3 討論

3.1 4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的纖維成分分析

飼料原料中日糧纖維除構成細胞壁的纖維素外，其它成分因原料不同而有所差異。玉米和小麥中日糧纖維以阿拉伯木聚糖為主，在雙子葉豆科植物中如大豆則主要為半乳甘露聚糖與酸性果膠物質。本試驗分析結果表明，在總日糧纖維的比例中，可溶性纖維所占比例以小麥NSP為最高，豆粕NSP次之，小麥麩NSP最低。

表3 肉仔雞盲腸食糜菌源發酵非淀粉多糖6、12、24 h后短鏈脂肪酸產量

Van Laar(2000)提取不同來源單子葉與雙子葉植物胚乳細胞壁時，在單子葉植物（小麥、裸麥及玉米）細胞壁中所含的蛋白質量一般值都很低，而在雙子葉植物一般約為4%左右，但大豆粕細胞壁上含有相當高的蛋白質。在NSP提取過程中，原料中存在不被酶液消化的蛋白質，以豆粕尤為明顯。這是由于豆粕中的蛋白質與NSP結合的比例較大，纖維與多糖類能將蛋白質包覆，進而使消化酶難以分解（Carre等，1985），導致NSP提取物中仍存在較大比例的未消化蛋白質。在本試驗中，豆粕NSP提取物粗蛋白含量為14.45%，大大低于Van Laar(2000)的報道，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低。這有利于減少蛋白質對NSP提取物發酵的影響。

3.2 非淀粉多糖體外發酵后短鏈脂肪酸產量和組成比例的比較

肉仔雞由于后腸較短，通常認為其對日糧纖維的發酵能力很有限。但近年來，隨著功能性寡糖和無抗生素日糧研究的深入，發達國家（尤其是歐盟）正在嘗試通過改變日糧纖維組成或添加外源性非消化寡糖來改善動物腸道微生態系統，以達到降低甚至停用飼用抗生素（Bedford，2000；Verstegen 等，2002）的目的，并在此基礎上提出了功能性纖維的概念（Prosky,2000;Guillon等,2000;Varley,2004）。因此，有必要認識和評價肉仔雞腸道微生物對非消化寡糖和日糧纖維的發酵利用。

體外發酵技術具有發酵條件一致、發酵時間一致、能夠準確測定發酵產物的產量及試驗費用低廉等優點，已被從反芻動物營養應用到非反芻動物營養上來（Ehle等，1982；Vickers等，2001）。盲腸是消化道微生物寄居肉仔雞的主要場所，本試驗體外發酵所使用的菌種來源于采食無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸。結果表明，玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素發酵產物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發酵時間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數發酵底物在第24 h產生丁酸的比例明顯增多。試驗結果與 Sunvold等（1995a、b、c、d）和Vickers等（2001）的基本一致，但短鏈脂肪酸產生速率更快，這可能是肉仔雞盲腸菌群數量相對較多的原因。

本試驗NSP的可發酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。這是由于NSP的特性不同，造成微生物對NSP的利用能力有所差異所致。小麥麩NSP和玉米NSP主要以不溶性日糧纖維為主，小麥NSP和豆粕NSP則含可溶性日糧纖維相對較多，不同特性日糧纖維影響微生物是否能侵入纖維間隙進行水解作用。日糧纖維在降解過程中受菌種種類不同與日糧纖維組成的影響（Rao等，1994）。可溶性日糧纖維較易被微生物發酵分解，因其持水性較高，使微生物容易侵入纖維間質中，但微生物難以侵入不可溶性日糧纖維的間質，以致無法快速降解纖維（Schneeman,1987）。Salvador等（1993）指出，當纖維呈現晶體狀結構時，能強烈地抵抗微生物水解酶，而小麥麩NSP為此類型的纖維結構，因此，降解速率和SCFA產量較低。當微生物無法降解纖維時，僅能產生較少的SCFA，進而影響微生物的生長與代謝。另外，某些可溶性NSP具有較高的黏滯性，也會影響腸道細菌對NSP的發酵。Choct等(1999)指出，雞腸道內容物的黏滯性增加，使食糜通過速率減慢，并增加腸道未攪拌水層的厚度，這些現象均會減少腸道中的含氧量，而適合厭氣菌的生長。在豆粕NSP組中，乙酸比例有較其它組高的趨勢，這是由于豆粕中的NSP與蛋白質結合牢固，本試驗提取NSP過程中雖用蛋白酶水解豆粕中的蛋白質，但粗蛋白仍達15.45%，這得以提供微生物利用，即以蛋白質為發酵作用的底物，而其產物乃以乙酸為主，故造成豆粕中含有較高比例的乙酸。Macfarlane等(1988)指出，微生物發酵時所使用的底物會影響到SCFA產量，一般以蛋白質作為發酵底物所產生的SCFA量會較以碳水化合物為基質的少。

本試驗在提取NSP過程中采用堿溶性NSP提取法，為的是保留更多的可溶性NSP。結果表明，與不可溶性NSP相比，可溶性NSP的發酵特點更接近于非消化寡糖。盡管如此，非消化寡糖和可溶性NSP對動物消化生理的影響還是有其不同之處的。可溶性NSP溶解后，通過分子之間相互纏繞，共價或非共價鍵連接成網狀結構，使水溶液呈現一定的黏滯性，這會降低胃的排空速率，影響腸道食糜的混合和營養素向腸道表皮細胞或吸收表面的擴散，結果造成飼料的消化和吸收的速率全面下降（Schwartz等，1982；Lin等，1992、1997）；與可溶性NSP不同的是，非消化寡糖在水溶液一般不表現黏滯性，但發酵產生的SCFA可增加食糜的流通速率。

4 結語

在本試驗中以采食無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸微生物為菌源的體外發酵條件下，以玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素為發酵底物。結果表明，上述NSP的發酵產物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發酵時間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數發酵底物在第24 h產生丁酸的比例明顯增多。玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素的可發酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。