高脂飼料對細鱗魚稚魚刷狀緣膜水解酶發育的影響

張 輝 牟振波 劉 敏 徐革峰

過去的20多年中，為配制能夠替代活餌的人工飼料，對稚魚消化道形態發育、各類營養物質適宜添加水平以及利用能力方面，進行了大量的研究工作，并為實踐應用打下了理論基礎。在消化能力的研究上，主要描述消化道水解酶分布與飼料對酶活性以及轉運能力的影響。

孵化后的仔魚表現出特殊的消化特征，此后會逐漸發育為接近成魚的消化模式。稚魚的早期發育階段對于飼料中營養物質的化學性質和含量水平高度敏感。稚魚對攝食營養物質的同化能力也會依賴于飼料成分、魚體消化酶和新陳代謝過程的調整能力。因此，消化酶的個體發育研究以及發育過程關鍵指標的測定，可能會解釋飼料成分添加量以及對發育的影響效應。

本研究目的是通過測定刷狀緣膜上水解酶的活性變化，分析并評價飼料成分與消化道刷狀緣膜水解酶發育之間的關系，以輔助確定飼料中脂類的適宜含量。

1 材料與方法

1.1 材料

稚魚采自黑龍江水產研究所渤海試驗站。

魚苗開口后，以水蚤投喂15 d。然后以水絲蚓與水蚤混合投喂10 d。此后，按照10尾/l的放養密度進行分池飼養在12個（內設4個小水槽）平列槽中，平均每個平列槽的稚魚數量為2000尾，每個小水槽的放養量為500尾。試驗期間，根據每次采樣后的估計數量調節水體體積，使養殖密度保持在10尾/l水平。試驗用水是來自于鏡泊湖的地下滲出水，經砂濾后使用。試驗過程中水溫保持在（13±2）℃，溶氧高于5 mg/l。

然后投喂蛋白含量為48%、脂類含量分別為15%、20%、25%和30%的人工飼料。飼料投喂前進行3 d的轉口和3 d的適應。對照組投喂水蚤和水絲蚓的生物餌料。試驗前期（0～15 d）每天投喂8次，后期每天投喂6次。

取開口15 d投喂生物餌料的稚魚以及試驗不同處理的稚魚，每10 d采集一次。每次采樣40尾，采樣前24 h停食。撈取樣本后，迅速放入液氮中保存，待分析。

1.2 方法

1.2.1 組織處理與腸道刷狀緣膜囊的制備

將液氮中的魚體在4℃冰水的載玻片上解凍。解凍后的魚體在冰水保溫的條件下，在解剖鏡下解剖處理為四部分：頭、軀干（含腹部肌肉）、鰓和胃腸道。取出的組織，以重量/體積為1：9比例溶于0.7%的生理鹽水中，用勻漿機以10000 r/min勻漿1 min，制成10%組織勻漿。將制備好的勻漿用低溫離心機，1000×g離心5 min，離心好的勻漿留上清液棄去沉淀，制成10%的勻漿液。然后，迅速在液氮中冷凍，保存于－80℃溫度冰箱中，待分析。

腸道刷狀緣膜囊的制備參照Crane等的兩步梯度離心方法并加以改進。根據水解酶富集程度判定刷狀緣膜囊的純度。

1.2.2 水解酶活性與蛋白濃度測定

γ－谷氨酰肽轉移酶（γ－GT，EC2.3.2.2）測定參見Naftalin等的方法，活性單位以U/mg prot表示；堿性磷酸酶（EC3.1.3.1）活性測定參見Beessey等方法，活性單位以U/mg prot表示；蛋白質濃度測定參照Bradford的方法。

①采用高強度水泥漿補強加固，首先鉆2～3個小孔，其作用是當做灌漿和出漿使用，并且孔的深度通常要比缺陷處深至少1m。

1.2.3 體重與成活率測定

取樣，用濾紙吸干水分后在電子天平下稱重。養殖試驗結束后，分別對每一處理的養殖成活率計算，得出4個平行成活率平均值，作為成活率結果。

1.2.4 飼料配方

稚魚投喂蛋白水平為48%，脂類水平分別為15%、20%、25%和30%的四個處理飼料。以投喂水蚤和水蚯蚓活餌為對照組，每處理四個平行。試驗中脂類水平分別用L1、L2、L3和L4代表由低到高的脂類飼料。微顆粒飼料的規格為200～800 μm飼料配方見表1。

表1 飼料配方

1.2.5 統計分析

統計分析采用SPSS10.0，進行F檢驗的方差分析。

2 結果

2.1 γ－GT活性

γ－GT活性測定結果見表2、圖1。

表2 γ－GT 活性測定結果（±SD,n=18）（U/mg prot）

表2 γ－GT 活性測定結果（±SD,n=18）（U/mg prot）

注：數據肩標含不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下表同。

時間（d）項目0對照L1處理L2處理L3處理L4處理2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 103.1±0.5b 2.5±1.1b 4.6±1.1a 5.2±2.1a 2.1±0.9b 202.3±1.1b 2.3±1.0b 4.8±2.0a 8.6±2.1c 5.5±1.2b 303.0±1.8b 4.0±0.6b 4.4±0.7a 9.0±1.9c 2.5±1.6b

圖1 γ－GT活性分布與變化趨勢

對照組活性變化不大，L1與L4處理相比的活性均有所增加，L1后期活性有明顯上升，但與L4相差不顯著。L2處理活性有升高，但在后期穩定，與同期各處理相比差異顯著。L3的活性呈升高狀態，在20 d和30 d時，酶活性趨于穩定，與其它處理相比差異顯著（P＜0.05）。這種水解酶活性的增強，說明飼料成分起到了決定性的作用，有利于對飼料的吸收和轉運。

2.2 AKP活性

AKP活性測定結果與變化趨勢見表3、圖2。對照組活性相對穩定，而L1、L2以及L4的活性與對照組相比卻略有降低，尤其是L1與L2的活性沒有增強，反而出現略微下降，但L1與L2兩組間差異并不顯著。L1經短期下降后有所升高，而L4呈上升狀態，后期活性升高，并高于 L1和 L2，但差異不顯著（P＞0.05）。L3的活性表現出穩定的升高，后期的活性要高于其他處理，并保持上升態勢，且與其它試驗組相比差異顯著（P＜0.05），說明水解能力逐漸增強。

表3 AKP 測定結果（±SD,n=18）（U/mg prot）

表3 AKP 測定結果（±SD,n=18）（U/mg prot）

項目 時間（d）0對照L1處理L2處理L3處理L4處理10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 1012.0±3.4a 6.7±2.1b 10.7±2.6b 11.5±3.3a 8.7±2.1b 2011.0±2.0a 8.1±3.6b 8.9±3.7b 13.5±3.3a 9.9±1.6b 3012.7±3.8a 8.2±0.6b 8.8±2.2b 13.8±2.3a 11.7±3.1b

圖2 AKP活性分布與變化趨勢

2.3 增重與存活率（見表4、表5、圖3）

表4 高脂飼料養殖仔魚增重情況（mg/尾）（±SD,n=40）

表4 高脂飼料養殖仔魚增重情況（mg/尾）（±SD,n=40）

時間（d）項目0對照L1處理L2處理L3處理L4處理154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.510216.7±15.4177.8±15.3181.9±19.8233.9±20.9257±22.320285.0±20.1238.5±28.9280.8±24.3279.7±24.3290.8±25.430332.3±24.3301.3±28.7320.3±29.6347.7±30.9316.7±28.9

表5 養殖成活率情況（%）

圖3 48%蛋白飼料對細鱗魚仔魚生長的影響

從生長結果看，L3生長最好，終體重超過了對照組水平，而前期要稍強于對照。10 d時，L4要好于對照與各處理組，但在以后生長中體增重率降低；L1與L2的結果近似，后期L1生長要弱于L2。終體重以L1最低。

成活率結果顯示，L3處理組要好于對照組與所有試驗組，但與對照相差不大，而遠高于L1和L4。

3 討論

與哺乳動物相比，對魚類消化酶研究還很有限。在研究魚類的投喂方法時必須考慮到對多種飼料的消化能力。消化能力的成熟情況直接會反映出攝食習性與飼料源的利用。

本試驗設計研究細鱗魚稚魚的脂類營養需求。用配合飼料作為單一的飼料源進行應用是一項正在廣泛研究的內容。對海水魚類仔魚進行了替代生物餌料的全人工飼料的營養研究，即以15 d的仔魚為對象，研究飼料對發育的影響。實際上，在此發育階段的稚魚一般以攝食活餌、水蚤或水絲蚓為主。投喂可以滿足營養需求的人工飼料以替代活餌，并降低生產成本。由于缺乏有關早期營養需求研究的資料，故尚無法解釋這一階段的人工飼料的技術問題。選擇以碳水化合物調節飼料脂類含量的平衡配方可以降低替代物質的影響；而且，以往的試驗說明非營養性填充物質，如纖維素等，會強烈地降低稚魚的生長，結果導致營養研究的誤差。

3.1 腸道刷狀緣膜水解酶

一般魚類的消化道上皮細胞的發育至少要在孵化后4周完成。這種成熟過程已經在哺乳動物和魚類中得到證實。腸道消化的發育可以通過刷狀緣片段上的細胞內消化酶、亮氨酰丙氨酸肽酶，與刷狀緣膜上酶、堿性磷酸酶的比率來反映，從而判斷發育階段的細胞內消化與外消化的程度。而刷狀緣膜上酶的活性，主要是γ-GT和AKP，可以反映刷狀緣膜的水解能力，間接判斷腸道細胞對飼料的分解能力。

腸道與粘膜發育對營養物質非常敏感，高水平的不飽和脂肪酸可以起到促進刺激成熟的作用，而高水平脂類促進了舌齒鱸稚魚腸道的發育，并且是mRNA轉錄水平的變化。本試驗處理中，脂類水平高于15%的飼料，刷狀緣膜上酶活性有明顯提高。而適宜的脂類水平（25%）、腸道γ-GT和AKP都有顯著升高，可能起到了促進消化道成熟的作用，這種現象可能也是由于刷狀緣膜水解酶活性有了較高的表達。而試驗中不飽和脂肪酸的變化主要來自于大豆油，其中含有的不飽和脂肪酸多是短鏈的不飽和脂肪酸，長鏈脂肪酸含量很少。這種水解酶活性升高的情況是由于脂肪含量，還是不飽和脂肪酸含量作用的結果尚不清楚。細胞內消化是否受到影響也有待于研究。而且，飼料中不飽和脂肪酸與磷脂的適宜添加量能否起到類似作用也是未來研究的課題。

3.2 增重與成活率

本試驗中投喂人工飼料可以產生良好的增重效果。終體重最低的是L1處理。飼料脂類含量由15%升高到30%，終體重最大可以相差15%以上。經30 d的試驗，最大增重可達1倍以上，說明魚體生長需要較高的能量。但這種生長是否造成魚體脂類的過渡增加，而影響到蛋白質積累尚有待分析。

同樣，飼料脂類水平也影響到了成活率，過低或過高的脂類成活率均較低。成活率最高的是L3處理，接近于生物餌料培養的情況。雖然在生長上的差異并不顯著，但成活率上卻出現了較大差異。在有些處理中，如L1和L2個別個體體重達到500 mg，這種情況說明，相當多的個體生長可能是處于不良的生理狀態，即出現大小規格不齊。結果表明，飼料中適宜的脂類含量可能是在20%～25%之間，略高于虹鱒的需求量，低于大西洋鮭的添加量。

4 結論

①當蛋白質含量為48%時，細鱗魚稚魚的脂類需求量在20%～30%之間。

②適宜的飼料脂類水平可以增強稚魚刷狀緣膜水解酶活性，而過高的脂類水平會產生抑制作用。飼料脂類水平影響到了腸道上皮細胞的成熟，適宜的脂類水平可以促進腸道成熟以及對飼料成分的利用能力。

[1]Halver J E,Hardy R W.Fish Nutrition,3rd edition.Academic Press Inc.,San Diego,2002：259-308.

[2]Vanderhoof J A.Regulatory peptides and intestinal growth[J].Gastroenterology,1993,104:1205-1208.

[3]Zambonino Infante J L,Cahu C L.High dietary lipid levels enhance digestive tract maturation and improve Dicentrarchus labrax larval development[J].Journal of nutrition,1999,129:1195-1201.

[4]Chakrabarti I,Gani M D A,Chaki K K,et al.Digestive enzymes in 11 freshwater teleost fish species in relation to food habit and niche segregation.Comp.Biochem.Physiol.,A 1995,112:167-177.

[5]Crane R K,Boge,Rigal A.Isolation of brush border membranes in vesicular form from the intestinal spiral valve of the small dogfish(Scyliorhinus canicula)[J].Biochim.Biophys.Acta,1979,554:264-267.

[6]張輝，單安山，劉敏.細鱗魚仔魚腸上皮細胞刷狀緣膜囊制備方法的研究[J].中國飼料，2008(10):16-19.

[7]Naftalin L,Sexton M,Whitaker J F,et al.A routine procedure for estimating serum γ-glutamyl transpeptidase activity. [J].Clin.Chim.Acta,1969,26:293.

[8]Bessey O A,Lowry O H,Brock M J.Rapid coloric method for determination of alkaline phosphatase in five cubic millimeters of serum[J].J.Bio.Chem.,1946,164:321-329.

[9]Marion Bradford.A rapid sentative method for the quantitiation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[10]Brinkmeyer R L,Holt G J.Highly unsaturated fatty acids in diets for red drum (Sciaenops ocellatus)larvae [J].Aquaculture.1998,161:253-268.

[11]Watanabe,T.and Kiron,V.Prospects in larval fish dietetics[J].Aquaculture,1994,124:223-251.

[12]Cahu C L,Zambonino Infante J L.Early weaning of sea bass(Dicentrarchus labrax)larvae with a compound diet:effect on digestive enzymes[J].Comp.Biochem.Physiol.,1994,109A:213-222.

[13]Zambonino Infante J L,Cahu C L,Peres A.Partial substitution of di-and tripeptides for native proteins in sea bass diet improves Dicentrarchus labrax larval development[J].J.Nutr.,1997,127:608-614.

[14]Castell J D,Sinnhuber R E,Wales J H,et al.Essential fatty acids in the diet of rainbow trout(Salmo gairdneri):growth,feed conversion and some gross deficiency symptoms[J].Journal of Nutrition,1972,102:77-85.

[15]Hillestad M,Johnsen F,Austreng E,et al.Long-term effects of dietary fat level and feeding rate on growth,feed utilization and carcass quality of Atlantic salmon [J].Aquaculture Nutrition,1998,4:89-97.