維生素C對(duì)牙鲆仔魚(yú)存活率及抗應(yīng)激能力的影響

赫麗娟 王 鶴 任同軍 姜志強(qiáng) 韓雨哲

維生素C又名抗壞血酸，是魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物組織膠原蛋白合成過(guò)程中脯氨酸羥基化必需的物質(zhì)，具有廣泛的生理和免疫作用，能夠促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物快速生長(zhǎng)，緩解養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抵抗病原微生物感染能力及免疫功能[1]。維生素C對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、抗病、抗應(yīng)激和提高存活率等方面有重要的作用[2]。魚(yú)類(lèi)缺乏維生素C經(jīng)常出現(xiàn)脊椎彎曲、軟骨變形、膠原形成損傷、皮膚出血和內(nèi)臟出血等癥狀。由于大多數(shù)魚(yú)類(lèi)缺少合成維生素C所必需的L－古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶，因此，在體內(nèi)不能合成維生素C，只能通過(guò)食物獲取外源維生素C[3]。餌料中缺乏維生素C容易使魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)放慢，免疫功能減弱，病害增多，死亡率提高。由于仔魚(yú)階段魚(yú)苗的體質(zhì)較弱，因此需要在飼料中添加適量維生素C。維生素C對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的影響一直是魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與飼料研究的重點(diǎn)。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）原產(chǎn)地分布于北太平洋西部，我國(guó)黃海和渤海產(chǎn)量較大。牙鲆以其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛(ài)，市場(chǎng)需求旺盛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[4]。目前，牙鲆的營(yíng)養(yǎng)，特別是仔、稚魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)與飼料問(wèn)題較突出，雖然已有部分國(guó)產(chǎn)飼料應(yīng)用于生產(chǎn),但是仍有許多生產(chǎn)單位育苗飼料需要依靠進(jìn)口[5]。有關(guān)牙鲆對(duì)維生素C的需要報(bào)道較多，但基本上都集中在牙鲆幼魚(yú)和成魚(yú)階段的研究，而對(duì)牙鲆仔魚(yú)階段的研究較少。文中主要研究不同劑量的維生素C對(duì)褐牙鲆仔魚(yú)階段存活率以及抗應(yīng)激能力的影響，為配制牙鲆仔魚(yú)的配合飼料提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)飼料

1.1.1 飼料的配制

飼料主要的蛋白源為魚(yú)粉、磷蝦粉和魷魚(yú)粉；基礎(chǔ)飼料主要原料為混合維生素（不含有維生素C）、混合礦物質(zhì)、n-3系列不飽和脂肪酸、魚(yú)肝油、α-糊精等。VC的添加使用的是VC磷酸酯，VC磷酸酯的有效抗壞血酸含量為35%，并將不同量的維生素C添加到配合飼料中，使其達(dá)到試驗(yàn)所要求的含量標(biāo)準(zhǔn)。將這些成分加入粘合劑使之充分混合，處理成片狀后烘干，24 h后取出放入研缽中研碎，過(guò)100目篩，篩下物即可作為試驗(yàn)飼料使用。飼料配方及飼料編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 飼料配方（g/kg干物質(zhì)）

1.1.2 飼料成分的測(cè)定

水分測(cè)定采用恒溫干燥法(105℃)；粗蛋白測(cè)定采用半微量凱氏定氮法；粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法；粗灰分測(cè)定采用馬福爐灼燒法(550℃)[6]。飼料的營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表2 飼料的營(yíng)養(yǎng)成分（%）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔魚(yú)是由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站提供的全雌牙鲆卵，在大連水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孵化。前期飼養(yǎng)階段，將初孵仔魚(yú)放入170 cm×90 cm×56 cm，容積0.86 m3的暫養(yǎng)池中，仔魚(yú)開(kāi)口后投喂輪蟲(chóng)，輪蟲(chóng)的投喂密度為2～3個(gè)/ml水體。投喂的褶皺臂尾輪蟲(chóng)，是在本實(shí)驗(yàn)室由土池培養(yǎng)的輪蟲(chóng)休眠卵孵化而來(lái)，輪蟲(chóng)培養(yǎng)密度保持在160個(gè)/ml以上，輪蟲(chóng)培養(yǎng)前期投喂本實(shí)驗(yàn)室三級(jí)培養(yǎng)的小球藻液以及酵母，由于小球藻液數(shù)量有限，培養(yǎng)后期改為小球藻濃縮液。投喂前，將輪蟲(chóng)用稀釋100倍的輪蟲(chóng)強(qiáng)化劑（0.8～0.9 g/百萬(wàn)個(gè)）強(qiáng)化12 h后投喂。經(jīng)過(guò)三周的前期飼養(yǎng)，挑選規(guī)格整齊的仔魚(yú)平均放入15個(gè)160 L的塑料圓桶中進(jìn)行流水式養(yǎng)殖，每桶放牙鲆仔魚(yú)350尾左右。仔魚(yú)的初始規(guī)格：平均體長(zhǎng)為（8.2±0.6）mm，平均體重為（3.8±0.5）mg。

試驗(yàn)由2009年3月31日至2009年4月20日，共21 d。飼養(yǎng)階段7:30～17:30，每小時(shí)投飼一次。每日上午9:00虹吸法吸底，同時(shí)清除殘餌及糞便，整個(gè)飼養(yǎng)階段采用微流水養(yǎng)殖，水流速度約為0.1 l/min，24 h充氣。室溫使用空調(diào)控制，控制室溫在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定在25℃。每天記錄飼養(yǎng)仔魚(yú)死亡尾數(shù)。同時(shí)測(cè)定鹽度、水溫以及溶氧等水質(zhì)指標(biāo)，試驗(yàn)期間，鹽度為33±1，水溫 15～17 ℃，溶氧 6.63～7.78 mg/l(YSI,550I,USA)。

1.3 高溫應(yīng)激試驗(yàn)和露空試驗(yàn)

將15桶試驗(yàn)仔魚(yú)分別隨機(jī)取出10尾，將仔魚(yú)分別放入200 ml的燒杯中，將燒杯置于25℃的恒溫水浴中2 h，每5 min檢查其存活情況，記錄死亡量。

將15桶試驗(yàn)仔魚(yú)分別隨機(jī)取出10尾，離水，放于干燥的篩絹網(wǎng) (100目)上，5 min后，將試驗(yàn)仔魚(yú)無(wú)傷的放回裝有原槽水的新水槽中，3 h后觀察試驗(yàn)仔魚(yú)的存活情況，并記錄死亡量。

1.4 計(jì)算方法

存活率(%)=[（初始尾數(shù)－死亡尾數(shù)）/初始尾數(shù)]×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±S.D.）表示，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析（One－way ANOVA），并對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan's法多重比較，以P＜0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行處理，并用Excel 2003制表、制圖。

2 結(jié)果（見(jiàn)圖 1、2、3）

圖1 不同維生素C含量飼料對(duì)牙鲆仔魚(yú)存活率的影響

不同維生素C含量的飼料對(duì)牙鲆仔魚(yú)存活率的影響如圖1所示。從結(jié)果可以看出，牙鲆仔魚(yú)的存活率受飼料中維生素C含量的影響。在飼料中添加1.43 g/kg維生素C磷酸酯(L－AMP)能顯著提高牙鲆仔魚(yú)的存活率(P＜0.05)，繼續(xù)升高飼料中L－AMP含量則不會(huì)繼續(xù)顯著提高牙鲆仔魚(yú)的存活率。

圖2 不同維生素C含量飼料對(duì)牙鲆仔魚(yú)高溫應(yīng)激后存活率的影響

不同維生素C含量的飼料對(duì)牙鲆仔魚(yú)的高溫應(yīng)激能力產(chǎn)生了影響，結(jié)果如圖2所示。用不添加維生素C的飼料飼喂的牙鲆仔魚(yú)高溫應(yīng)激后的存活率顯著低于飼喂添加2.86 g/kg和5.72 g/kg L－AMP的飼料組(P＜0.05)，即飼料4和飼料5。飼料中添加1.43 g/kg以上維生素C磷酸酯(L－AMP)的各組間高溫應(yīng)激后，牙鲆仔魚(yú)的存活率沒(méi)有顯著差異。

圖3 不同維生素C含量飼料對(duì)牙鲆仔魚(yú)露空應(yīng)激后存活率的影響

飼料中維生素C含量的不同并未對(duì)牙鲆仔魚(yú)抗露空應(yīng)激的能力產(chǎn)生顯著影響（見(jiàn)圖3）。但是未添加維生素C的飼料組飼喂的牙鲆仔魚(yú)，在露空應(yīng)激后存活率最低（P＞0.05）。

3 討論

維生素C是水產(chǎn)動(dòng)物所必需的重要維生素。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物其主要的生理功能：首先，維生素C作為水產(chǎn)動(dòng)物重要的免疫增強(qiáng)劑而發(fā)揮作用[3]。其次，維生素C能提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗逆性[7]。第三，維生素C對(duì)飼料中某些微量添加劑有正協(xié)同效應(yīng)，起到節(jié)約飼料中的微量添加劑的作用，維生素C能促使葉酸轉(zhuǎn)變成四氫葉酸，協(xié)助酪氨酸的代謝，減輕維生素A、維生素B1等的缺乏癥[8]。第四，維生素C對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物骨骼的發(fā)育有重要的影響[7]。第五，維生素C對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的行為有所影響[9]。

本研究中，飼料中添加1.43 g/kg的VC磷酸酯能顯著提高牙鲆仔魚(yú)的存活率(P＜0.05)，但是繼續(xù)升高飼料中的VC含量，并不會(huì)顯著提高牙鲆仔魚(yú)的存活率(P＞0.05)。添加0.29 g/kg VC磷酸酯的飼料飼喂的牙鲆仔魚(yú)，其存活率并未顯著高于未添加VC的飼料。結(jié)果表明，飼料中添加一定量的維生素C能提高牙鲆仔魚(yú)的存活率。這也與之前的許多試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，Ai等[7]在以L(fǎng)－APP為維生素C源對(duì)花鱸（Lateolabrax japonicus）維生素C需求量的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加489 mg/kg飼料或高于這個(gè)劑量會(huì)顯著地提高血清溶菌酶活力和血清替代補(bǔ)體活力。Lin等[10]在石斑魚(yú)（Epinephelus malabaricus）飼料中添加100%抗壞血酸，當(dāng)添加量達(dá)到生長(zhǎng)最適添加量（45.3 mg/kg飼料）的6倍時(shí)，能顯著增強(qiáng)石斑魚(yú)的非特異性免疫反應(yīng)并能在攻毒試驗(yàn)中顯著提高石斑魚(yú)的存活率。在本試驗(yàn)中，當(dāng)繼續(xù)升高維生素C的含量時(shí)，牙鲆仔魚(yú)存活率出現(xiàn)了平臺(tái)期，這種現(xiàn)象的原因可能是由于添加維生素C產(chǎn)生的短暫免疫增強(qiáng)后，試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)飼料中含有高劑量的維生素C環(huán)境出現(xiàn)了一定的適應(yīng)，并且在長(zhǎng)期試驗(yàn)的后期免疫功能無(wú)法體現(xiàn)[11]。張道波等[12]在以牙鲆幼魚(yú)為研究對(duì)象的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，牙鲆幼魚(yú)飼料適宜的維生素C添加量為400～600 mg/kg。但是在本試驗(yàn)中，牙鲆仔魚(yú)的適宜維生素C添加量應(yīng)高于1.43 g/kg，這個(gè)結(jié)論也證明了仔魚(yú)對(duì)維生素C的需求量高于幼魚(yú)。

本研究的結(jié)果表明，飼料中添加維生素C能顯著提高牙鲆仔魚(yú)的抗高溫應(yīng)激能力(P＜0.05)。高溫應(yīng)激存活率最高值出現(xiàn)在飼料中添加維生素C 2.86 g/kg的飼料組。高于保證飼養(yǎng)階段存活率最高值所需要的維生素 C 含量(P＞0.05)。Wahli等[13]在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的創(chuàng)傷恢復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加維生素C能顯著提高虹鱒魚(yú)的創(chuàng)傷恢復(fù)能力，并且高劑量的維生素C添加量不但不會(huì)引起恢復(fù)速度的減緩反而會(huì)引起其加快恢復(fù)。Alexis等[14]在對(duì)金頭鯛（Sparus aurata L.）的試驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果。飼料中維生素C的含量從0 mg/kg飼料增加到3.2 g/kg飼料，同時(shí)金頭鯛的創(chuàng)傷恢復(fù)速度與維生素C的添加量呈線(xiàn)性正相關(guān)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明在應(yīng)激刺激條件下，魚(yú)類(lèi)為了保證正常生理狀態(tài)所必需的維生素C的量有所增加。從另一個(gè)角度反映了維生素C作為水產(chǎn)動(dòng)物所必需的微量添加劑的生理功能。但是在露空應(yīng)激試驗(yàn)中，這個(gè)結(jié)果卻并不顯著。不添加維生素C組的飼料飼喂的牙鲆仔魚(yú)，其露空存活率僅略低于添加維生素C的各組飼料 (P＞0.05)。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于牙鲆仔魚(yú)對(duì)高溫應(yīng)激的抗逆性生理反應(yīng)機(jī)制與露空應(yīng)激不同，從而對(duì)維生素C的利用途徑不同所造成的[15]。具體的生理反應(yīng)需做進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

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