偏側咀嚼致咀嚼肌功能紊亂發病機制的研究

王子嫻 徐龍博 祁冬 林雪芬 應王貴 孫圣軍 陳彬 汲平，2

（1.山東大學口腔醫院 修復科；2.山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南 250012）

偏側咀嚼致咀嚼肌功能紊亂發病機制的研究

王子嫻1徐龍博1祁冬1林雪芬1應王貴1孫圣軍1陳彬1汲平1，2

（1.山東大學口腔醫院 修復科；2.山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南 250012）

目的 探討偏側咀嚼所導致的咀嚼肌功能紊亂的發生機制。方法 用原子分光光度法檢測Ca2+含量；用比色法檢測鈣調神經磷酸酶活性；用三磷酸腺苷酶（ATPase）染色檢測肌纖維類型。結果 1）除8周組外，實驗組拔牙側Ca2+含量均升高，且明顯高于對照組（P＜0.05）。其中，4周組Ca2+含量升高最為明顯。2）實驗組非拔牙側Ⅰ型肌纖維/（Ⅰ+Ⅱ）型肌纖維比例升高，高于正常對照組水平（P＜0.05）。3）CaN活性隨Ca2+含量的升高呈鐘形變化。4）慢肌纖維比例與CaN活性呈正相關（r=0.876，P＜0.05）。結論 高含量Ca2+激活了與骨骼肌生長和肌纖維轉化有關的信號通路，使肌纖維實現從快到慢的轉化。這可能是偏側咀嚼致咀嚼肌功能紊亂的發生機制之一。

偏側咀嚼； 鈣調神經磷酸酶； 肌纖維類型； 肌功能紊亂

偏側咀嚼是咬合功能紊亂的一種表現形式，也是一種常見的口腔疾病。長期偏側咀嚼會對口頜系統、主要是顳下頜關節和咀嚼肌的組織結構造成不同程度的影響，與顳下頜關節紊亂癥（temporomandibular disorder，TMD）的發病密切相關。TMD的臨床癥狀包括：顳下頜關節區及咀嚼肌疼痛，下頜運動異常和伴有功能障礙及關節彈響等。有些TMD患者就診時提出其咀嚼肌酸痛無力，難以忍受。那么為何一些經久不愈、病程遷延的顳下頜關節紊亂癥患者會出現上述癥狀呢？

大量研究[1-2]表明：骨骼肌類型的轉化對骨骼肌功能的改變有重要影響。為了深入研究TMD咀嚼肌損傷和疲勞發生的機制，本研究依據李寧毅等[3]的方法，模擬臨床患者長期缺牙后常出現偏側咀嚼的致病方式，建立偏側咀嚼動物模型，通過比較偏側咀嚼組與正常對照組以及拔牙側與對側的咬肌Ca2+、鈣調神經磷酸酶（calcinuerin，CaN）和肌纖維類型的變化，分析Ca2+和CaN、CaN和肌纖維類型之間的相關性，研究CaN在偏側咀嚼致咀嚼肌損傷中的作用，并從CaN影響肌纖維類型變化的角度探討TMD咀嚼肌功能紊亂的發生機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雌性Wistar大鼠36只（山東大學動物中心提供），約8周齡，每只質量250～300 g，無牙齒磨耗及牙頜畸形。

1.2 實驗方法

將36只Wistar大鼠用隨機數字表法先分成4組，每組9只，分別于拔牙2、4、6、8周后進行樣品的采集和制備。每組再按1∶2分為2組，一組3只為對照組，一組6只為實驗組即偏側咀嚼模型組。實驗組大鼠經腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1.2mL·kg-1）麻醉，全麻后置于手術臺上，用4條細繩分別固定大鼠的前后肢，正畸用結扎絲固定上切牙于手術臺上，用探針將大鼠口腔拉開，固定舌頭。拔除左側上頜后牙，術后給予抗生素控制感染。對照組不拔牙，其余操作同實驗組。

1.3 咬肌標本的制備

大鼠分批行頸椎脫臼法處死后，迅速切取咬肌中段淺層2mm×2mm×2mm大小，液氮冰凍，放入-80℃冰箱保存。取出剩余咬肌上段及下段，放入預冷（4℃）的生理鹽水中洗去余血，去除結締組織后，分別稱取0.4 g和0.2 g肌肉（濕重），于-80℃保存。

1.4 咬肌Ca2+含量的測定

取出存于-80℃冰箱中的咬肌組織，用原子吸收分光光度法測定鈣離子含量。取組織塊0.4 g，烘干，硝化，低溫凍干，在波長為422 nm的原子分光光度計（此波長為鈣離子的特異性曲線）上測定含量。測得數值表示為每克干重組織Ca2+/含量（μg·g-1）。

1.5 咬肌CaN活性的測定

應用德國Merke公司生產的CaN活性比色法測試盒進行CaN活性測定。

1.6 咬肌肌纖維類型的測定

取出標本，-20℃恒溫連續切片（片厚約6μm），吹干，冷丙酮固定10min，晾干，4℃保存。染色前取出，吹干，烤片，行三磷酸腺苷酶（adenosinetriphosphate，ATPase）染色。采用盲法，用DT2000圖像分析系統進行分析，根據ATPase活性差異，將肌纖維分為慢肌纖維（Ⅰ型），顏色淺灰；快肌纖維（Ⅱ型），顏色深灰。取均值，計算出慢肌纖維百分比構成（Ⅰ型纖維數/合計肌纖維數×100%）。

1.7 統計方法

用SPSS 16.0統計軟件對Ca2+含量、CaN活性和肌纖維類型比例各周組內對照組和實驗組及實驗組雙側間進行單因素方差分析和LSD檢驗，并對Ca2+和CaN、CaN和肌纖維類型比例進行相關性分析。

2 結果

2.1 咬肌組織中Ca2+含量

除8周組外，實驗組拔牙側Ca2+含量均有升高并且高于對照組（P＜0.05）；各組拔牙側Ca2+含量高于非拔牙側，其中，4周組Ca2+含量升高最為明顯，拔牙側高于非拔牙側，差異有顯著性（P＜0.05），見表1。

表1 咬肌Ca2+含量的變化Tab 1 Changes of Ca2+contents of masseter muscle μg·g-1，±s

表1 咬肌Ca2+含量的變化Tab 1 Changes of Ca2+contents of masseter muscle μg·g-1，±s

注：*P＜0.05。

組別 n 分側 Ca2+含量2周組對照組 3 對照側 27.51±2.13實驗組 6 拔牙側 31.37±4.01*非拔牙側 29.86±2.68 4周組對照組 3 對照側 44.98±4.10實驗組 6 拔牙側 53.61±1.60*非拔牙側 50.29±2.19* 6周組對照組 3 對照側 32.91±2.20實驗組 6 拔牙側 35.29±1.11*非拔牙側 34.20±2.82 8周組對照組 3 對照側 38.24±4.00實驗組 6 拔牙側 36.04±2.96非拔牙側 34.88±2.20

2.2 咬肌CaN活性

除2周組外，隨時間延長，實驗組雙側CaN活性有所升高（表2）。

表2 咬肌鈣調神經磷酸酶活性的變化Tab 2 Changes of CaN activities of masseter muscle nmol，±s

表2 咬肌鈣調神經磷酸酶活性的變化Tab 2 Changes of CaN activities of masseter muscle nmol，±s

注：*P＜0.05。

組別 n 分側 CaN活性2周組對照組 3 對照側 -1.14±0.07實驗組 6 拔牙側 1.17±0.05*非拔牙側 0.96±0.10* 4周組對照組 3 對照側 -0.18±0.01實驗組 6 拔牙側 -0.24±0.00非拔牙側 0.74±0.24* 6周組對照組 3 對照側 -0.03±0.01實驗組 6 拔牙側 -0.02±0.01非拔牙側 -0.05±0.00 8周組對照組 3 對照側 0.01±0.00實驗組 6 拔牙側 0.29±0.01*非拔牙側 -0.04±0.04

2.3 咬肌肌纖維類型

除2周組外，實驗組非拔牙側Ⅰ型肌纖維/（Ⅰ+Ⅱ）型肌纖維比例逐漸升高，高于拔牙側，高于正常對照組水平（P＜0.05），見表3。

表3 咬肌慢肌纖維類型的變化Tab 3 Changes of fibre types of massetermuscle %，±s

表3 咬肌慢肌纖維類型的變化Tab 3 Changes of fibre types of massetermuscle %，±s

注：*P＜0.05。

組別 n 分側 Ⅰ/（Ⅰ+Ⅱ）2周組對照組 3 對照側 61.69±2.39實驗組 6 拔牙側 76.88±3.14*非拔牙側 72.46±3.90* 4周組對照組 3 對照側 65.34±3.39實驗組 6 拔牙側 68.83±0.83*非拔牙側 74.27±2.09* 6周組對照組 3 對照側 71.42±1.47實驗組 6 拔牙側 73.03±1.69非拔牙側 85.55±1.79* 8周組對照組 3 對照側 66.68±3.84實驗組 6 拔牙側 70.01±3.56*非拔牙側 72.58±2.47*

2.4 Ca2+含量和CaN活性的關系

由圖1看出，CaN活性隨Ca2+含量升高呈鐘形變化。當Ca2+含量為31.56μg·g-1時，CaN活性達到峰值。

圖1 咬肌Ca2+含量和CaN活性Fig 1 Ca2+contents and CaN activities of masseter muscle

2.5 CaN活性與肌纖維類型的關系

如散點圖2所示，慢肌纖維所占總肌纖維的比例與CaN活性呈正相關（r=0.876，P＜0.05）。

圖2 咬肌CaN活性與肌纖維類型比例Fig 2 CaN activities and ratio of fibre type of masseter muscle

3 討論

有學者[4]實驗得出，大鼠正常的咀嚼模式為雙側對稱，頻率基本相同。通過磨牙法可觀察到大鼠咀嚼時下頜切點運動軌跡隨著磨牙時間的增長，口腔靜止時下頜相對于上頜有位移，偏向健側，形成了偏側咀嚼習慣，用大鼠來建立偏側咀嚼的動物模型是可行的。本實驗采取拔除一側后牙造成的偏側咀嚼動物模型是公認的比較成熟的模型。雖然拔牙可能會使咀嚼肌組織結構產生一定程度的病理變化，但在本實驗中觀察到所有大鼠的拔牙創均在5～8 d愈合，2周后牙槽窩基本平復，因此對本實驗結果不會有影響。

偏側咀嚼造成了牙合紊亂，為適應其變化，神經肌肉活動及局部循環均有一定的改變，伴隨而來的是肌肉功能的改變與損傷，它是由可逆性向不可逆性逐漸變化與發展的。但是目前這種損傷發生的機制尚未十分明確。

3.1 偏側咀嚼引起Ca2+含量的持續升高

多年來，Ca2+都被認為是與調控骨骼肌生理機能密切相關的第二信使，在骨骼肌損傷與疲勞的同時總是伴隨著細胞內Ca2+含量的升高。Ca2+可能是通過細胞膜上的Ca2+通道進入細胞內；或者是各種原因引起細胞膜損傷而造成胞外Ca2+內流；Ca2+的泵出發生障礙也是使Ca2+水平持續升高的原因。Bani等[5]通過磨除大鼠一側后牙牙尖造成錯牙合實驗發現：2周后細胞內Ca2+含量出現明顯的升高。隨后，Ca2+含量持續升高。這同本研究結果相似。8周時，實驗組雙側Ca2+含量均低于對照組，可能與機體代償及咬肌內出現大量新生肌纖維有關[6]。傳統組織病理學觀點認為，生物體成熟的骨骼肌細胞屬于終末分化細胞，一旦遭受破壞，就成為永久性的功能障礙和組織缺失。而現代創傷修復學認為再生是創傷愈合的始動和基礎，事實上骨骼肌的損傷和再生是一個連續病理過程中的不同階段[7]。Ruiz-Bonilla等[8]也證實成年大鼠骨骼肌中同樣存在骨骼肌的再生。

3.2 CaN對慢肌纖維基因表型的下調作用

根據組織化學染色方法，通常將骨骼肌分為2大類：慢肌（Ⅰ型）和快肌（Ⅱ型）。其化學特征反映，Ⅰ型纖維在咀嚼的強大收縮中產生高張力，耐疲勞；Ⅱ型纖維適宜維持姿勢和嚼磨等中等力量的持續收縮，易疲勞。咀嚼肌多以Ⅱ型纖維占優勢。肌纖維類型的轉化可以通過多種不同的信號通路和分子機制進行調控。目前研究比較多的2條途徑是肌源調節因子途徑和鈣:鈣調磷酸酶途徑。

高含量的Ca2+可以激活鈣依賴性信號傳導途徑CaN通路，國內外學者普遍認為CaN是骨骼肌重塑的重要信號分子[9-10]。研究[11]發現：CaN足以激活生物體內編碼慢肌纖維表型的基因程序。本研究中慢肌纖維基因顯型隨CaN活性升高出現上調的趨勢，也證實了CaN對慢肌纖維的調控作用。另外有學者[12]指出：單純CaN的存在不能完全掌控慢肌纖維的轉化與維持。這也解釋了本實驗中雖然CaN活性隨Ca2+含量升高而呈鐘形變化，但慢肌纖維比例依舊持續升高，同時提示關注另一種鈣依賴性信號傳導途徑——CAMK通路。隨著Ca2+含量變化CaN活性呈鐘形曲線變化，這種現象可能是由于組織中的CaN內源性抑制因子作用而產生的[13]。Mu等[14]通過實驗得出：分別阻斷CaN或CAMK信號通路均能觀察到骨骼肌纖維由快到慢的轉變，然而，只有當2條通路協同作用時，才能使肌纖維發生最大程度的轉化。本實驗CaN活性隨時間的變化并無明顯的規律可循。分析可能是由于骨骼肌中鈣調神經磷酸酶含量較少且樣本含量小，從而導致結果無統計學意義。

3.3 偏側咀嚼與咀嚼肌功能紊亂

咀嚼肌功能紊亂是指咀嚼肌疼痛，張口痛性受限，下頜運動不協調，咀嚼無力等一系列癥狀綜合征。發病因素為咬合異常、下頜的過度運動、精神因素、偏側咀嚼習慣、神經衰弱等。本實驗結果證明偏側咀嚼組雙側肌纖維類型變化明顯，非拔牙側慢肌纖維所占比例顯著高于拔牙側，左右同名肌不對稱指數增加。Hylander等[15]研究得出偏側咀嚼時非咀嚼側關節所承受的壓力大于咀嚼側，由于左右兩側所處的生物機械環境不同，其組織反應亦不相同，結果顯示非咀嚼側的病理變化較咀嚼側顯著。這也正是本實驗中非拔牙側比拔牙側肌纖維類型改變明顯的原因。

根據本實驗，偏側咀嚼導致TMD患者的咀嚼肌功能紊亂的機制可能是：長期偏側咀嚼引起咀嚼肌組織中Ca2+含量升高。高含量的Ca2+激活了大量與骨骼肌生長和肌纖維轉化有關的信號通路，激活后的信號通路促進編碼慢肌表型蛋白基因轉錄，誘導肌纖維實現從快到慢的轉化，左右同名肌不對稱指數增加，下頜運動不協調，出現咀嚼肌功能紊亂。本研究為TMD的臨床治療提供了新的靶點，可以從抑制鈣依賴性信號通路著手[16]，通過調控肌纖維類型的轉化，來維持咀嚼肌的正常功能，從而減輕咀嚼肌紊亂綜合征患者的痛苦。

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（本文編輯 湯亞玲）

Research about the mechanism in masticatory muscle dysfunctional induced by hem imastication

WANG Zixian1,XU Long-bo1,QI Dong1,LIN Xue-fen1,YING Wang-gui1,SUN Sheng-jun1,CHEN Bin1,JI Ping1，2.（1.Dept. of Prosthodontics,College of Stomatology,Shandong University,Jinan250012,China；2.Key Laboratory of Oral Biomedicine of Shandong Province,Jinan250012,China）

ObjectiveTo study the mechanism in masticatory muscle dysfunctional induced by hemimastication.MethodsCa2+contents were measured with atomic absorption spectrometry;calcinuerin were measured with colorimetric method;muscle fiber types were measured with adenosine-triphosphate（ATPase）staining.Results 1）Compared with the controls,Ca2+contents in experimental group had the higher level except 8 weeks（P＜0.05）.2）The ratio of slow fiber in experimental group increased,higher than the match groups（P＜0.05）.3）With Ca2+contents rise，the activities of calcinuerin present a bell-like shape.4）The ratio of slow-type fiber was positively correlated to the activities of calcinuerin（r=0.876，P＜0.05）.ConclusionThe signal way of muscle fiber growth and fiber transformation were activated by high concentration of calcium，then，muscle fiber transfered from fast to slow type.It may play an important role in the mechanism that hemimastication result in masticatory muscles dysfunction.

hemimastication； calcinuerin； muscle fiber type； masticatory muscles dysfunction

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.023

1000－1182（2011）01－0096-04

2010-05-10；

2010-09-14

山東省自然科學基金資助項目（Y2006c216）

王子嫻（1984—），女，山東人，碩士

汲平，Tel：0531-88382448