雙側腎動脈不全結扎法建立腎前性急性腎衰動物模型

李卓然，黃 迪，盛 旦，趙 娟，葉 靜，陳 寧

（天津醫科大學1.臨床醫學七年制；2.病理生理學教研室，天津300070）

急性腎功能衰竭（acute renal failure,ARF）是由各種原因引起的腎泌尿功能在短時間內急劇下降而出現的臨床綜合征。其中由腎缺血因素導致的ARF占50%。短期缺血時所出現的急性腎功能衰竭，通常為腎灌注減少導致腎小球濾過率降低所致。逆轉血流動力學損害，會使腎功能迅速恢復。但若低灌注持續，可發生腎小管細胞損傷，從腎前性（功能性）轉向腎性(器質性)急性腎功能衰竭[1-2]。因此及時恢復腎血流對患者的治療和預后都有重要意義。目前教學和科研中所用的急性腎衰模型多為汞中毒和缺血-再灌注損傷所致的器質性急性腎衰[3]。本實驗旨在復制出更貼近臨床實際病因，體現治療理論基礎的缺血性急性腎衰，為教學科研提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 主要藥物、試劑和儀器 20%烏拉坦溶液，常規手術器械，膀胱漏斗，輸液器，頸動脈插管，自制計尿器，直徑0.70～0.90mm漁線，普通離心機（國產），i-STAT臨床血液分析系統（美國Abott公司出產），P模塊全自動生化分析儀（瑞士Roche公司產品）。

1.2 動物模型的制備 教學實驗用健康新西蘭白兔8只（由天津醫科大學實驗動物中心提供），體重1.6～2.2kg，雌雄不拘，雌者不孕。耳緣靜脈注射20%烏拉坦全身麻醉，經靜脈補充120～150ml生理鹽水以增加基礎尿量。輸液期間暴露膀胱并置入連接膠管的膀胱漏斗；分離雙側腎動脈并穿線備用；頸總動脈插管以備取血。停止輸液10min后，記正常15min尿量，取0.5mL動脈血做血氣分析，并另取血1.5mL以備肌酐及電解質檢測。然后將腎動脈與長0.80cm、直徑為0.90mm的漁線一并結扎，隨即取出漁線，造成腎動脈狹窄、腎血流減少的病理狀態。缺血5min后開始收集尿液，并于15min后記錄尿量，同時再次取血檢測上述指標。缺血20min后剪斷結扎線恢復腎動脈血流，隨后每15min記錄所收集的尿量1次并于恢復血流后30、60min時各取血1次。除腎動脈結扎前、結扎后20min及恢復腎動脈血流60min時所取供血氣分析的血樣立即檢測外，其余所取血液標本離心后取血清保存于-20℃備檢。分別在正常、缺血20min、恢復血流1h和5h時取左腎，做病理檢查。

1.3 腎功能測定 用最小刻度為0.1mL的小量器收集尿液并記錄尿量。采用Roche全自動生化分析儀及試劑，用P模塊、酶法測定血清肌酐。采用電極法測定鈉、鉀、氯。使用i-STAT臨床血液分析系統做動脈血氣分析。

1.4 組織病理切片 將所取一側腎臟于10%中性甲醛中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察各時段兔腎組織病理形態學變化。

2 結果

2.1 尿量 比較實驗各階段收集的15min尿量，雙側腎動脈結扎后（after ligation,AL）實驗動物的尿量明顯少于結扎前(before ligation，BL)，恢復腎血流后（after resuming perfusion,ARP）尿量回升，15～30min期間的尿量增多達到峰值，之后回降到接近正常水平。見圖1。

2.2 血清肌酐（Cr）水平 與結扎前比較，腎動脈不全結扎后動物血清Cr水平顯著升高(P<0.01)，恢復血流后30min其水平已有顯著下降（P<0.05），至恢復血流60min時下降更甚（P<0.01），與結扎前相比已無統計學差異。見表1。

表1 家兔血清肌酐及電解質的變化（±s）Tab 1 Changes of serum creatinine and electrolytes in rabbits

表1 家兔血清肌酐及電解質的變化（±s）Tab 1 Changes of serum creatinine and electrolytes in rabbits

**P＜0.01vs BL；△P＜0.05，△△P＜0.01vs 20minAL

時間BL 20min AL 30min ARP 60min ARP Cr(μmol/L) n=875.56±8.0590.64±10.28** 82.88±12.53△78.48±11.22△△Na+（mmol/L）n=5146.28±4.16147.30±5.57134.08±19.81142.90±3.91K+(mmol/L) n=52.82±0.312.95±0.392.68±0.542.84±0.17Cl-(mmol/L) n=5104.32±3.02106.74±2.6797.18±16.38104.20±4.14

2.3 血清鈉、鉀、氯檢測 經重復測量分析各時段鈉、鉀、氯水平雖無統計學差異，但可見在腎動脈不全結扎20min后，血清鉀水平呈升高趨勢；隨腎血流恢復，血清鈉、鉀、氯水平均呈下降變化，惟血鉀水平下降后又有所回升。見表1。

2.4 動脈血氣分析 實驗動物腎動脈結扎后20min時，動脈血pH值及碳酸氫鹽（HCO3-）值均較結扎前下降，而剩余堿（BE）負值增大。血流恢復60min后pH及HCO3-下降更加明顯；BE負值繼續增大。見表2。

表2 家兔動脈血氣指標變化（n=4，±s）Tab 2 Changes of blood gas in rabbits（n=4，±s）

表2 家兔動脈血氣指標變化（n=4，±s）Tab 2 Changes of blood gas in rabbits（n=4，±s）

*P<0.05,**P<0.01vs BL；△P<0.05,△△P<0.01vs 20min AL

時間BL 20min AL 60min ARP pH 7.42±0.077.40±0.067.35±0.05*△PaCO2(mmHg) 31.56±4.2430.83±4.3630.4±4.66HCO3-(mmol/L) 20.04±3.3419.51±4.91* 17.05±4.22**△BE(mmol/L) -3.86±5.05-5.29±5.74* -8.75±4.92*△△

2.5 兔腎病理形態學檢查 將各時段兔腎組織于光鏡下觀察，缺血20min及恢復血流1h和5h兔腎腎被膜光滑，皮髓質結構清楚，腎小球體積未見縮小或肥大，數目未見減少，各腎小管上皮細胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結石，腎間質未見炎細胞浸潤及纖維組織增生，腎盂上皮完整，與未結扎的正常兔腎相比無著變。

3 討論

腎臟是機體最重要的排泄器官，急性腎功能衰竭是臨床常見的危重病癥。為更加明確其發病機制和探索新的治療方法，在科研和教學中很多學者從不同角度、采取多種不同的方法制作急性腎功能衰竭的動物模型。目前采用的主要有以下2種方法：(1)肌內或皮下注射HgCl2復制急性中毒性腎功能衰竭動物模型[4-5]。(2)用動脈夾夾閉腎蒂，缺血一定時間后恢復血液灌流，造成缺血-再灌注損傷，進而形成急性腎衰動物模型[6-7]。但相對于低灌注來說，毒物并不是造成ARF的主要原因；而后一種模型已超過腎缺血本身對腎功能影響及其所導致的缺血性急性腎衰的范疇。此外雖可見通過腎動脈或靜脈注射內毒素或去甲腎上腺素等藥物造成急性腎衰動物模型的報道，但是也存在難以預料實驗個體反應的問題[8-9]。能夠在實驗過程中控制雙腎缺血程度的腎前性急性腎衰模型，目前尚鮮有報道。

經查閱相關文獻[10-11]和大量預實驗，最終選定以直徑0.90mm的漁線進行雙側腎動脈不全結扎，并在腎缺血20min后恢復血流的方法制作急性功能性腎衰模型。結果顯示雖然動物個體之間尿量差異較大，但總體看來，在雙側腎動脈不全結扎人為造成腎動脈狹窄狀態，導致腎灌注量減少后，由于腎小球濾過率下降，出現了尿量減少。而同期的肌酐水平顯著升高則顯示了腎小球濾過功能受損造成了代謝產物的蓄積。此外，腎排泄功能下降還導致了代謝性酸中毒相應的血氣變化和血清鉀的上升。缺血20min后恢復腎血流，尿量隨之逐步增多，至恢復腎血流30min時達到高峰，然后趨向正常。結合血清肌酐、電解質檢測及病理檢查，分析這種變化可能與前期腎排泄功能下降導致代謝產物潴留，隨著腎濾過功能的恢復，代謝產物排出增多而引起的滲透性利尿有關[12]。至于恢復血流60min時血清鉀水平又呈上升趨勢，則不能排除尚存的代謝性酸中毒的影響。綜合上述腎缺血后出現多重腎功能障礙表現、及時恢復血流后腎功能很快就得以改善恢復，以及病理切片沒有發現腎單位結構發生著變的實驗結果，提示所復制出的動物模型具有功能性急性腎功能衰竭的特征。

為提高模型成功率，通過大量預實驗，摸索出以下經驗：(1)為保證在短時間內收集到肉眼可見的基礎尿量，對于缺水的實驗用兔，最好于實驗前經靜脈補充適量生理鹽水。(2)缺血時間以20min為宜，時間過短不足以造成顯著的病理生理變化，時間過長，則可造成器質性損傷（如缺血30min后再恢復血流，病理上表現為光鏡下部分腎小管上皮細胞有空泡變性及間質灶性淋巴細胞浸潤），同時還存在再灌注損傷的可能。(3)根據家兔腎動脈粗細，可對結扎所用漁線的型號進行必要的調整。

綜上所述，以雙側腎動脈不全結扎方法復制出的急性腎功能衰竭動物模型，體現了腎缺血因素在急性腎功能衰竭發生及治療方面的作用，使學生在基礎醫學學習階段即可體驗到與臨床實際的密切聯系。該方法要求的實驗工具和操作技術簡易，內容豐富，可為開展腎前性（功能性）急性腎衰有關的實驗教學和臨床科研提供實驗參考。

（本研究得到天津醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室王永明老師、天津醫科大學代謝病醫院檢驗科郭蓓老師的大力支持，在此一并致謝）

［1］ 徐長慶.腎功能不全[M]//金惠銘，王建枝.病理生理學.第7版.北京：人民衛生出版社，2008:248-265

［2］ 錢家麒.急性腎衰竭[M]//王吉耀.內科學.北京：人民衛生出版社，2005：618-623

［3］ 張麗莙，朱學良.急性腎衰竭[M]//婁建石.機能學實驗.北京：人民衛生出版社，2007：160-161

［4］ Zhao ZG,Niu CY,Zhang YP,et al.Pancreatic injury in rabbits with acute renal failure[J].Ren Fail,2009,31(10):977

［5］ Augusti PR,Conterato GM,Somacal S,et al.Effect of astaxanthin on kidney function impairment and oxidative stress induced by mercuric chloride in rats[J].Food Chem Toxicol,2008,46(1):212

［6］ 陳彥文，嚴蘇純.百紅膠囊對家兔急性腎缺血再灌注損傷中MDA、SOD及Ca2+的影響作用[J].中華中西醫學雜志，2002，4(1):11

［7］ Pinheiro HS,Camara NO,Noronha IL,et al.Contribution of CD4+T cells to the early mechanisms of ischemia-reperfusion injury in a mouse model of acute renal failure[J].Braz J Med Biol Res,2007, 40(4):557

［8］ Cichy MC,Rocha FG,Trist?o VR,et al.Biomarker and drug-target discovery using proteomics in a new rat model of sepsis-induced acute renal failure[J].Kidney Int,2006,70(3):496

［9］ 肖文星，賓建平，許頂立.去甲腎上腺素對腎臟血流影響的研究進展[J].新鄉醫學院學報，2005，22（4）：400

［10］張福林，孔祥林，吳細香,等.犬腎組織不可逆性損害模型的建立[J].中國危重病急救醫學，2004，2(2):112

［11］符慶瑛，李著華.腎缺血再灌注損傷中微血管損傷防治的研究進展[J].微循環學雜志，2004，14(1)：50

［12］胡維誠.腎功能障礙[M]//陳主初.病理生理學.北京:人民衛生出版社，2005：344-365