Calpain-1在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠心肌中的表達(dá)及意義

趙 紅，徐 梅，初桂蘭

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，天津300052）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）大多源于胎兒宮內(nèi)窘迫及新生兒窒息，是新生兒期危害極大的常見病，也是新生兒死亡的主要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)在缺氧、缺血過程中心肌細(xì)胞除發(fā)生壞死外還發(fā)生凋亡，且在缺氧、缺血早期凋亡細(xì)胞數(shù)量多于壞死細(xì)胞[1]。鈣蛋白酶1（Calpain-1）與心肌細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，又由于其在心肌細(xì)胞中的特殊分布，從而引起廣泛的關(guān)注。本研究擬構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，觀察Calpain-1在HIBD大鼠心肌中的表達(dá)，探討其在心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生7日齡Wistar大鼠64只，健康，雌雄不限，體質(zhì)量12～18g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所實驗動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d各組，每組各8只大鼠。各組平均體質(zhì)量差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.1.2 主要儀器及試劑 在GenBank中查找到大鼠Calpain-1mRNA（NM-019152.2），Calpain-1、Rat Actin-bate（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成），Taq酶、dNTP Mixture、Ribonuclease inhibitor、Random Primer、cDNA合成試劑盒（Takara公司,中國），總RNA提取試劑（Invitrogen公司,美國），DEPC(Promega,美國)，Marker及兔抗大鼠calpain-1抗體、β-Actin、RIPA組織細(xì)胞裂解試劑盒(Santa cruz公司,美國)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(北京中山公司)，ECL試劑盒(Thermo公司,美國)，Bio-Rad DC protein assay試劑盒 (Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，Bio-Rad電泳儀及電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)Kodak 440CF(Kodak，美國)，熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）等。TUNEL試劑盒(KeyDEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 HIBD模型的建立及組織制備 采用改良的Rice法[2]構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，大鼠行頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈后雙重結(jié)扎，并從兩重結(jié)扎線中間剪斷血管。術(shù)后將HIBD組大鼠置于缺氧箱中，持續(xù)通入8%O2+92%N2的混合氣體2h，氣流量1L/min。蘇醒后返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)，代乳后飼養(yǎng)環(huán)境一致，假手術(shù)組頸總動脈僅分離不結(jié)扎不做缺氧處理。HIBD組在設(shè)定時點(diǎn)HIBD后2、12、24h及2、3、5、7d斷頭處死，迅速取出心臟分成2部分，一部分置于液氮中保存?zhèn)溆茫硪徊糠纸?jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后制成切片。假手術(shù)對照組與HIBD后2h組同時處死。

1.2.2 TUNEL檢測的操作步驟及結(jié)果判定 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合，0.1mol/L PBS（pH7.4）浸浴15min×2次；封閉液室溫固定30min后PBS浸浴15min×2次；透膜液室溫浸浴3～5min；玻片在PBS緩沖液中浸浴5min×2次；加TUNEL標(biāo)記反應(yīng)混合物20～25μL，濕盒內(nèi)37℃孵育1h，輕輕搖洗5min×3次；拋去PBS，每張蓋玻片加1：1000的HOCHEST染核，暗室內(nèi)室溫孵育10min；再經(jīng)PBS搖洗5min×3次拋去PBS,經(jīng)熒光顯微鏡觀察熒光，激發(fā)波長450～500nm，發(fā)射波長515～565nm，TUNEL混合液中不加TdT的切片作陰性對照，陽性的凋亡細(xì)胞核呈綠色，陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。每切片隨機(jī)選擇10個視野，高倍鏡下計數(shù)500～1000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，其陽性細(xì)胞百分率即為凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）。

1.2.3 RT-PCR法測定心肌組織Calpain-1mRNA表達(dá)量 按照Trizol試劑說明書在心肌組織中抽取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA后用于PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參，Rat Actin-bate引物序列：上游引物5′-GGA GATTACTGCCCT GGCTCCTA，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，擴(kuò)增片段150bp；Calpain-1引物序列：上游引物5′-GGGGTG AAGTGGAGTGGA AAG，下游引物5′-TTA AGGGCGTCAGGT GTA AGG，擴(kuò)增片段184bp，反應(yīng)條件：Rat Actin-bate預(yù)變性 94℃ 5min，變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)27次，結(jié)束循環(huán)后再延伸72℃8min；calpain-1預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)35次，結(jié)束循環(huán)后再延伸72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，分別獲得 213bp、298bp和 749bp的條帶，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像及定量掃描儀分析，以目的片段/內(nèi)參照β-actin片段的條帶光密度比值作半定量比較。

1.2.4 Western blot檢測Calpain-1蛋白活性 按說明書配制細(xì)胞裂解液，以每1g心肌組織加3mL裂解液的比例制成組織勻漿，冰浴1h后4℃離心10min，取上清液。按照說明書配置BCA蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)液，應(yīng)用酶標(biāo)儀測出樣品的吸光度并計算出組織上清液的蛋白含量。蛋白質(zhì)樣品沸水加熱10min后置于冰水中冷卻，加入10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，再將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上4℃封閉過夜。加入兔抗大鼠Calpain-1抗體37℃孵育2h，洗膜后再加入辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，加入ECL發(fā)光底物用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)的曝光，PVDF膜于分子量80kD和76kD處顯示特異的蛋白信號。應(yīng)用QuantityOne-4.1.0軟件對所得特異性蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行圖分析，蛋白質(zhì)條帶的含量以O(shè)D值表示，將Calpain活性片段的OD值與總片段的OD值比較即76kD/80kD比值代表Calpain-1蛋白的活性。比值越大，說明陽性反應(yīng)程度越高，目標(biāo)蛋白活性越強(qiáng)，反之則表示目標(biāo)蛋白活性越弱。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 對照組偶見凋亡細(xì)胞，HIBD組凋亡細(xì)胞均有明顯增加（P<0.01）。與對照組相比，AI自HIBD后2h組開始有明顯增加（P<0.01），3d達(dá)高峰（P<0.001）后開始降低，7d仍明顯高于對照組（P<0.01）。如以對照組AI均數(shù)作為基數(shù)，HIBD組大鼠AI增加在2.5～19.1倍，尤以HIBD后3d組為著（19.1倍）。如圖1、2所示。

圖1 對照組（×200）Fig 1 Control group（×200）

2.2 大鼠心肌細(xì)胞Calpain-1mRNA、蛋白活性變化 大鼠心肌中Calpain-1mRNA表達(dá)量自HIBD后12h增多（P<0.01），2d達(dá)高峰，表達(dá)量在3～5d仍維持在較高水平（P<0.001）；Calpain-1蛋白在分子量80kD處對照組信號最強(qiáng)，HIBD后逐漸減弱；76kD的信號在對照組最弱，HIBD后逐漸增強(qiáng)，2d時76kD信號強(qiáng)度超過80kD，3d時76kD的信號最強(qiáng)。Calpain-1蛋白活性在HIBD后2h增高（P<0.05），24h～2d顯著增高 (P<0.001)，3d達(dá)高峰；5d有所下降，7d與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見圖3、表1。

圖3 對照組及HIBD各時點(diǎn)組蛋白條帶Fig 3 Western blot analysis of calpain-1of control and HIBD groups

表1 大鼠心肌組織AI(%)與Calpain-1mRNA、蛋白活性變化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

表1 大鼠心肌組織AI(%)與Calpain-1mRNA、蛋白活性變化（±s）Tab 1 Changes of apoptosis index and expressions of calpain-1gene and protein in myocardium of rats（±s）

組別對照組HIBD后2h 12h 24h 2d 3d 5d 7d mRNA 0.0363±0.02920.0788±0.02850.1962±0.06500.3525±0.03370.5400±0.08480.3200±0.05150.1825±0.05770.0838±0.0306Calpain-1P 0.1040.0000.0000.0000.0000.0000.07076kD/80kD 0.1001±0.03200.1875±0.03730.1562±0.08870.7200±0.08810.8502±0.10001.0479±0.10930.6752±0.09710.1031±0.0157P 0.0300.1590.0000.0000.0000.0000.937細(xì)胞AI(%) 1.5250±0.22813.8500±1.11739.0374±1.420214.7125±2.242723.1750±2.726429.1625±5.14117.5500±2.51054.1125±0.1394P 0.0050.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3 心肌細(xì)胞AI與Calpain-1之間相互關(guān)系 Calpain-1mRNA、蛋白活性與AI之間呈直線正相關(guān)(r=0.786，P=0.000；r=0.853,P=0.000)

3 討論

細(xì)胞凋亡是主動性細(xì)胞死亡形式，在維持機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)和生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，同時也參與了眾多疾病的病理過程。既往認(rèn)為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等終末細(xì)胞不會發(fā)生凋亡反應(yīng)，直到1989年，Nepomniashchikh等觀察饑餓性心肌萎縮超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白合成降低，細(xì)胞數(shù)減少，由此初步提出饑餓性心肌萎縮是由細(xì)胞凋亡所致。隨后Gottlieb和Kawano等采用電鏡結(jié)合DNA凝膠電泳方法才取得了心肌細(xì)胞凋亡的直接證據(jù)，同時Tanaka等在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中也證實了凋亡的存在。心肌細(xì)胞的功能和代謝特點(diǎn)決定了心肌細(xì)胞對缺氧非常敏感，大量研究已證實，缺氧能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[3-5]。劉英等[4]采用TUNEL法證實了HIBD過程中心肌細(xì)胞凋亡的存在；李剛等[6]利用Annexin-V/PI雙染色流式方法證明新生大鼠HIBD發(fā)生后心肌細(xì)胞存在明顯凋亡。

Calpains是鈣依賴性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員之一，廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動物組織中。Calpain-1是最早被發(fā)現(xiàn)也是研究較清楚的Calpain家族成員之一，胞內(nèi)Ca2+的濃度為微摩爾時即被激活，并隨著Ca2+濃度不同出現(xiàn)的結(jié)果也不同。Ca2+濃度逐步提高可導(dǎo)致Calpain-1構(gòu)象改變，使之具有了蛋白水解酶活性；Ca2+濃度進(jìn)一步提高Calpain-1將發(fā)生自溶，其N端部分氨基酸序列被水解，使Calpain-1的80kD大亞基降解為76kD，此時酶原形式變?yōu)榛钚孕问健Ｉ頎顟B(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度總是保持在極低的水平，心肌細(xì)胞在缺氧缺血時，鈣離子通道開放，鈣大量流入細(xì)胞，鈣泵功能下降，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載。對體內(nèi)及體外各種模型的研究顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞遇到缺氧、缺血等刺激時，Calpain-1因細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷而被激活，活化后的Calpain-1作用于細(xì)胞骨架蛋白、膜蛋白、鈣影蛋白、ATP酶等，產(chǎn)生一系列能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的“信號”載體，使其結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5，7]。Inserte等[8]發(fā)現(xiàn)，Calpain能夠在大鼠心臟缺血再灌注早期被激活，通過切割細(xì)胞骨架上的fordrin蛋白及ankyrin蛋白，致使錨定于細(xì)胞膜的Na+-K+-ATPase脫離，喪失功能，致使[Na+]i無法恢復(fù)，[Ca2+]i持續(xù)上升，進(jìn)一步惡化細(xì)胞內(nèi)的離子環(huán)境，加重Ca2+超載的程度激活更多的Calpain，形成惡性循環(huán)，起始對細(xì)胞的損傷過程。陳運(yùn)清等[9]對風(fēng)濕性房顫患者研究發(fā)現(xiàn)，Calpain-1的含量與心房肌細(xì)胞凋亡呈明顯正相關(guān)，說明Calpain-1與心房肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，呈并行關(guān)系。本研究應(yīng)用TUNEL法對HIBD大鼠心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞凋亡，在HIBD后3d組中尤為明顯，其凋亡指數(shù)較正常心肌細(xì)胞增加了19.1倍，且HIBD后7d依然高于正常對照組2.7倍，此結(jié)果與劉英等[4]研究結(jié)果一致。HIBD后大鼠心肌Calpain-1mRNA及蛋白活性較對照組明顯增加，且隨著Calpain-1表達(dá)的上調(diào)，AI亦逐漸增多，兩者呈明顯正相關(guān)；本研究結(jié)果表明，缺氧缺血可誘導(dǎo)Calpain-1表達(dá)增強(qiáng)，而Calpain-1的過度激活參與了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Calpain-1的作用底物廣泛，它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑也是多方面的，主要表現(xiàn)在對凋亡途徑的調(diào)節(jié)。在對HL-1心肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Ca2+超載時，線粒體膜電位降低的同時伴隨著Calpain活性的上調(diào)，通過Calpain抗體標(biāo)記染色發(fā)現(xiàn)Calpain出現(xiàn)在線粒體的位置，提示Calpain引起線粒體功能的異常[10]。在各種病理狀態(tài)下，Calpain被過度激活，一方面參與病理狀態(tài)的維持與加重；另一方面與內(nèi)外源性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加對Calpain-1的激活起著至關(guān)重要的作用，盡管Calpain-1參與了心肌細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚不十分清楚，但可以肯定的是與缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)鈣超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的“最后共同通路”，在細(xì)胞凋亡中有重要作用。因此，進(jìn)一步研究Calpain在細(xì)胞凋亡中的作用有助于深入了解細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其在疾病防治中的作用。

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