U73122和SQ22536對豚鼠視網膜色素上皮細胞分泌bFGF的影響

曾麗明，張未娟，鄧志宏，苗英彬，楊瑞波，張 琛，趙少貞

（天津醫科大學眼科中心屈光角膜科，天津300384）

目前人們對近視眼發病機制的研究還處于探索階段。在已知的近視信使中有兩種生長因子可影響實驗近視的發生，即堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）與β轉化生長因子（TGF-β）[1-2]。動物實驗研究表明，bFGF對近視的眼軸延長提供了一個停止信號，對小雞遮蓋眼行玻璃體或球結膜下注射bFGF均能抑制形覺剝奪性近視眼的形成，而且與bFGF成劑量相關性[2]。體外研究表明視網膜色素上皮（RPE）細胞可以分泌bFGF、TGF-β2等生長因子[3]。在RPE細胞內可能存在某種信號傳導途徑調節bFGF和TGF-β的分泌，再作用于鞏膜影響鞏膜的生長，導致近視的發生。本研究利用磷脂酶C抑制劑U73122和腺苷酸環化酶抑制劑SQ22536，分別阻斷豚鼠RPE細胞的磷脂酶C信號轉導途徑和腺苷酸環化酶信號轉導途徑，分析其對RPE細胞分泌bFGF的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 CO2培養箱（美國Forma公司），倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司），培養板、培養瓶（美國Corning公司），DMEM-F12培養基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司）。U73122（Sigma公司）溶于DMSO備用，SQ22536（Sigma公司）溶于雙蒸水，PBS配成5mg/mL備用。bFGF Elisa kit（ADL公司）。

1.2 豚鼠RPE細胞培養及鑒定 2～3周齡斷乳三色豚鼠，腹腔注射水合氯醛過量麻醉處死，迅速摘取眼球，剔除眼周組織，PBS沖洗，浸泡于含200IU/mL慶大霉素的PBS中（4°C，20～30min）。取出眼球用PBS沖洗2～3次，于裝有PBS的培養皿中沿鋸齒緣剪開眼球，去除眼前節部分及玻璃體和神經視網膜層，置于干凈平皿中撕下色素膜，浸于0.25%的胰酶中37°C消化10～15min。加入培養液吹打，離心（1000r/min，5min），棄掉上液，加入培養液吹打，200目細胞篩過濾，收集于培養瓶中培養。原代用含20%FBS的DMEM-F12，傳代后用10%FBS。2～3d后第1次換液，洗掉未貼壁的細胞。

5～7d后細胞長滿傳代。先加入少量0.25%的胰酶消化30s，用PBS輕洗，棄去洗液以去除貼壁不牢的其他細胞。再加入胰酶于37℃孵箱中消化1～2min，震蕩后可見細胞脫落時加入含10%FBS的培養液終止消化，吹打后移入離心管，離心（1000r/min，5min），按1∶3比例傳代。培養約30～60min時稍震蕩轉移細胞懸液至另一培養瓶以去除貼壁快的成纖維細胞[5]。取第2代細胞，上皮細胞特異的角蛋白免疫組化染色鑒定后用于實驗。

1.3 ELISA檢測bFGF的分泌量 第2代細胞接種于96孔板，待細胞長滿后換無血清培養液，24h后換含1×10-5mol/L U73122或1×10-5mol/L SQ22536的無血清培養液，分別于換液后2、4、6、8、16、24、48h收集培養液，-20℃保存。按試劑盒說明步驟嚴格操作檢測TGF-β2的分泌量。

1.4 統計學分析 用統計學軟件SPSS16.0進行分析。統計方法采用配對資料的t檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 RPE細胞原代培養及鑒定 原代的豚鼠RPE細胞含有豐富的色素，體積大而扁平，呈多角形或圓形向周圍伸展，可見細胞核分裂相。傳代后色素減少，細胞近融合時形態近六角形。免疫組化角蛋白染色RPE細胞為棕黃色陽性反應。

2.2 U73122及SQ22536對RPE細胞分泌bFGF的影響 加入1×10-5mol/L U73122后，實驗組bFGF的分泌量與對照組相比，2、4、6、8、16h均有降低（P值分別為：0.016、0.001、0.001、0.002、0.032）（圖1），24、48h bFGF的分泌量變化實驗組與對照組相比差異無統計學意義（P值分別為：0.183、0.428）。其中，8、16h降低最顯著（圖2），不同時間組的分泌量變化以（對照組－加藥組）×100%/對照組表示。

加入1×10-5mol/L的SQ22536后，bFGF的分泌量在48h內不同時間點實驗組與對照組相比均有所降低（圖3）（P值分別為：0.014、0.001、0.002、0.004、0.008、0.136、0.035），4、48h降低最顯著（圖4），其中24h降低與對照組相比無統計學意義（P>0.05）。

圖1 加入U73122后各時間點對照組和實驗組bFGF的分泌量Fig 1 The secretion of bFGF in different time points of U73122-treated group and the control group

圖2 加入U73122后RPE細胞分泌bFGF隨時間的變化量Fig 2 Comparison of bFGF secreted by RPE cell in different time noints of U73122-treated group

圖3 加入SQ22536后各時間點對照組與實驗組bFGF的分泌量Fig 3 The secretion of bFGF in different time points of SQ22536-treated group and the control group

圖4 加入SQ22536后RPE細胞分泌bFGF隨時間變化量Fig 4 Comparison of bFGF secreted by RPE cell in different time points of SQ22536-treated group

3 討論

近視眼作為一個全球性的醫學和社會問題，已引起人們廣泛關注。明確近視的發病機制是有效控制近視發生發展的關鍵，因此對近視眼的發病機制的研究成為近年來的熱點。其中“視網膜局部調控學說”認為，視網膜感知外界環境變化后產生一級近視信號因子（如RA、多巴胺、血管活性腸肽等）并作用于RPE，使之產生二級信號因子（bFGF、TGF-β2等），進而調控鞏膜的生長,形成近視[4]。而bFGF和TGF-β2已被多種動物實驗及體外實驗證實與近視發生發展密切相關[5-6]。毛俊峰等[7]認為，外源性bFGF可能通過某些中介因子調控鞏膜MMP—2mRNA表達，抑制形覺剝奪性近視（FDM）形成。黃瑞堯等[8]發現，豚鼠FDM中視網膜Mailer細胞中bFGF表達減弱。目前，在RPE細胞內通過何種途徑調控bFGF的分泌仍未見報道，本實驗著重研究RPE細胞通過何種信號轉導途徑調控bFGF的分泌。

細胞跨膜信號轉導通路主要有以下兩條[9]：(1)腺苷酸環化酶（AC）信號轉導途徑。(2)磷脂酶C（PLC）信號轉導途徑。RPE細胞在感受到視網膜產生的一級近視信號因子后，有可能是通過以上兩條途徑之一來調節bFGF的分泌。

U73122是磷脂酶C和A2抑制劑，它可以抑制磷脂酰肌醇水解生成第二信使1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二脂（DAG），導致胞質中游離Ca2+減少，從而抑制磷脂酶C信號傳導途徑，影響細胞的多種功能。SQ22536是一種細胞滲透性的腺苷酸環化酶抑制劑，它可以抑制AC活性，降低cAMP水平，從而抑制AC信號轉導途徑。

本實驗采用了以上兩種信號通路的抑制劑，分別作用于RPE細胞，初步了解bFGF分泌的調節與哪條信號轉導途徑有關。研究結果顯示：濃度1× 10-5mol/L U73122作用于RPE細胞后，bFGF的分泌量2h開始降低，bFGF分泌抑制8、16h最顯著, 24、48h bFGF的分泌量的變化與對照組相比無統計學意義(P>0.05)，結果提示：濃度1×10-5mol/L的PLC抑制劑U73122作用于RPE細胞2h，bFGF的分泌即受到抑制，張未娟等[10]的研究發現，PLC抑制劑U73122能抑制RPE細胞的增生,U73122作用于RPE細胞后從4h開始TGF-β2分泌明顯增加，另有研究證實TGF-β對bFGF的分泌有抑制作用[11]，本研究中bFGF分泌抑制從2h開始8h達高峰，推斷U73122可能是通過抑制PLC信號轉導途徑使TGF-β2的分泌增加，從而間接抑制bFGF的分泌，由于實驗條件限制，我們尚不能肯定。后期作用消失，有可能是由于藥物劑量不足，也有可能受RPE細胞內其他因素的影響，有待進一步研究。

濃度1×10-5mol/L的AC抑制劑SQ22536作用于RPE細胞2h開始抑制其分泌bFGF，在各時間點bFGF的分泌量與對照組相比均有降低，僅24h不明顯，考慮可能與實驗誤差有關，bFGF分泌抑制在4h達高峰后，作用又迅速減弱，其后呈現無明顯規律的波動，48h又達到高峰，而濃度1×10-5mol/L SQ22536對RPE細胞的增生及TGF-β2的分泌影響不明顯[10]，因此我們推測RPE細胞內可能存在其他因素與AC信號轉導途徑共同調控bFGF的分泌。

綜上所述，我們認為RPE細胞分泌bFGF可能受AC信號轉導途徑和PLC信號轉導途徑的共同調控，其具體作用機制及在RPE細胞內bFGF的分泌還受哪些因素的影響，有待進一步研究。

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［9］ 周愛儒.生物化學[M].第5版.北京:人民衛生出版社，2000：331-342

［10］張未娟，趙少貞，鄧志宏.U73122和SQ22536對視網膜色素上皮細胞增生及分泌TGF-β2的影響[J].眼科研究，2010，28（6）：519

［11］鄭曉汾，褚仁遠.TGF-β對體外培養人胚視網膜色素上皮細胞的影響[J].眼科研究，2007，25(1)：14