APE1、VEGF在非小細胞肺癌組織中的表達及其與預后的關系

沈春燕，穆海玉，王 忱，多 健，佟仲生

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.武警醫學院附屬醫院腫瘤科，天津300162；3.天津醫科大學腫瘤醫院，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（APE1/ref-1）是人體內一種重要的多功能蛋白，它既是細胞內DNA堿基切除修復(BER)途徑中的限速酶，又是一種氧化還原因子，可以調控多種核轉錄因子的氧化還原狀態，進而影響細胞的生長和分化。近年來研究發現，APE1為一種腫瘤相關基因，在多種惡性腫瘤中呈過度表達，并與患者預后相關[1-3]，但其機制尚不明確，可能與增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性和促進惡性腫瘤的血管生成等因素相關[4-6]。筆者的前期工作表明APE1與晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的化療耐藥性存在聯系[7]，因此，我們進一步采用免疫組化法檢測APE1和VEGF在可手術NSCLC中的表達，同時測定腫瘤內微血管密度（MVD），嘗試探討APE1、VEGF在非小細胞肺癌中的表達情況、與血管生成的關系及其對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 自2004年1月～2005年1月在武警醫學院附屬醫院和天津醫科大學附屬腫瘤醫院行手術治療，臨床資料及隨訪資料完整的肺癌患者共計101例，存檔石蠟標本中符合實驗條件的共有78例。其中男47例，女31例，年齡32～77歲，平均56歲。43.59%（34/78）的患者無吸煙史。行肺葉切除術+淋巴結清掃術的患者45例，行全肺切除術+淋巴結清掃術的患者33例。根據AJCC癌癥分期第6版的臨床分期，其中Ⅱ期53例，Ⅲ期25例。根據2000年WHO肺和胸膜腫瘤組織學分類標準，經組織學證實鱗癌43例，腺癌35例。生存期的計算從手術日期到末次隨訪日期，或由于復發轉移而死亡的日期為止。

1.2 實驗方法 78例NSCLC組織標本經過石蠟包埋，切片后應用SABC免疫組織化學法檢測APE1和VEGF的表達情況，血管內皮特異標記物CD34標記并計數腫瘤MVD。鼠抗人APE1單克隆抗體購于Novus Biologicals公司，兔抗人VEGF單克隆抗體和鼠抗人CD34單克隆抗體購于Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購于北京中杉生物有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。

1.3 結果判定 APE1陽性物質定位于細胞漿及部分胞核，VEGF則主要表達于細胞漿。在高倍光鏡下選取10個視野，觀察計數1000個細胞。陽性細胞數記分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度記分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項相加為最終判定結果：1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為 (++)，6～7分為 (+++)，其中-和+記為低表達，而++和+++記為高表達。CD34陽性染色定位于血管內皮細胞，呈現棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇團。MVD計數方法為在高倍鏡(×200)下計數每一視野的微血管數目，取平均值即為MVD。

1.4 統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行數據分析，率的比較采用χ2檢驗，相關性采用spearman相關分析，計量資料分析采用t檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，采用COX回歸模型進行多因素生存分析。P< 0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 APE1、VEGF表達特點及其與MVD計數的關系 APE1陽性產物呈棕黃色顆粒狀，主要在肺癌細胞的胞漿表達，部分分布于胞核，見圖1；VEGF主要表達于細胞漿，呈棕黃色至深棕色顆粒狀，見圖2。APE1、VEGF的高表達率分別為：78.2%（61/ 78）和64.1%（50/78）。表1示Spearman等級相關分析，APE1與VEGF表達在NSCLC中呈正相關（r=0.382，P=0.001）。同時，經t檢驗顯示：APE1蛋白高表達組MVD值（27.56±8.14）明顯高于低表達組（22.17±8.96）（t=2.365，P=0.021），VEGF蛋白高表達組MVD（28.59±7.68）值明顯高于低表達組（22.45±8.76）（t=3.222，P=0.002）。

圖1 APE1在非小細胞肺癌中的表達(×100)Fig1APE1expression in NSCLC(×100)

圖2 VEGF在非小細胞肺癌中的表達 (×100)Fig2VEGF expression in NSCLC(×100)

表1 NSCLC中APE1與VEGF表達之間的關系Tab 1 Correlation between APE1and VEGF expression in NSCLC

2.2 APE1、VEGF及MVD計數與NSCLC臨床病理因素的關系 APE1在吸煙者、淋巴結轉移者中表達顯著升高（P=0.047和P=0.016），VEGF在腫瘤直徑大于等于5cm組、中低分化程度組和有淋巴結轉移組表達顯著升高（P=0.011、P=0.022和P=0.035），MVD值與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關（P= 0.025和P=0.029），見表2。

2.3 APE1及VEGF表達與NSCLC患者預后的關系 Kaplan-Meier生存分析顯示，腫瘤大小、淋巴結轉移、APE1表達、VEGF表達與生存率相關（P= 0.000、P=0.000、P=0.003和P=0.009），見圖3～6。進一步行COX多因素分析顯示，腫瘤大小、淋巴結轉移和APE1表達是影響本組非小細胞肺癌患者生存率的獨立危險因素（P=0.000、P=0.000和P=0.027）；回歸系數為正值，表示隨因素程度的增加，患者的死亡危險度（RR）相對增加，見表3。

表2 APE1、VEGF表達及MVD計數與臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between APE1,VEGF expression,MVD and clinicopathologic features

圖3 78例非小細胞肺癌腫瘤大小和總生存期的關系Fig 3 Relationship between the tumer size and overall survival in 78NSCLC patients

圖4 78例非小細胞肺癌淋巴結轉移和總生存期的關系Fig 4 Relationship between the lymph node matastasis and overall survival in 78NSCLC patients

圖6 78例非小細胞肺癌VEGF表達和總生存期的關系Fig 6 Relationship between the expression of VEGF and overallsurvival in 78NSCLC patients

表3 NSCLC預后因素的多因素COX回歸分析Tab 3 COX regression modal multivariate analysis for prognosis in NSCLC

3 討論

原發性肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率分別居男性惡性腫瘤的首位和女性惡性腫瘤的第2位，而死亡率在男性和女性惡性腫瘤死因中均為第1位[8]。因此，很多學者致力于探討有關肺癌新基因的治療靶點和通路，嘗試新的研究策略，提高治療效果，而APE1則是近年來的研究熱點之一。

APE1基因位于人第14號染色體，編碼蛋白約37kD，含有318個氨基酸殘基，其N末端主要為氧化還原調控區，而C末端主要為核酸內切酶活性區[9]。APE1是多功能的DNA堿基切除修復途徑的限速酶，是細胞DNA放射性和化學性損傷的重要修復因子，其過表達可以促進堿基切除修復完成。同時，APE1也是一種重要的氧化還原因子，可以調節細胞內多種重要的核轉錄因子如HIF-1α、P53、NF-κB等蛋白的表達[9-10]，從而影響細胞的生物學特性。腫瘤血管形成是一個非常復雜的過程，它與許多基因的改變、多種細胞因子的正負性調節、細胞內外微環境的改變均有關系，與惡性腫瘤的生長和轉移關系密切。VEGF是經典的促血管形成因素之一，可作用于血管內皮細胞，使其分化而形成新的血管，并增加血管通透性，在腫瘤生長、浸潤、轉移過程中起重要作用[11]。

本研究顯示，APE1在NSCLC中的高表達率為78.2%，且與吸煙和淋巴結轉移相關，這也證實BER修復基因在吸煙等因素刺激下可以表達上調，與Yoo等[12]的報道相似。VEGF在本組NSCLC中的高表達率為64.1%，并與腫瘤大小、分化程度和淋巴結轉移相關。經Spearman相關分析表明，二者表達存在相關性。HIF-1α是目前較為肯定對VEGF存在調控的核因子，而APE1對VEGF的調控也極有可能通過這一通路實現。因此，這一機制可能為：APE1高表達可以增強HIF-1α的轉錄活性，而HIF-1α則可以增強VEGF mRNA的穩定性和轉錄活性[13-14]，從而促進VEGF過表達，我們認為APE1可能參與腫瘤血管生成機制，促進血管生成。

MVD是較為常用的評價血管生成的指標，因此我們采用CD34抗體免疫標記血管內皮細胞，計算本組病例標本的MVD。在本研究中，APE1高表達組的MVD，高于低表達組；VEGF高表達組的MVD，亦高于低表達組，均具有統計學意義。APE1及VEGF高表達的腫瘤中，血管生成則更為活躍。大多數研究認為MVD值高提示腫瘤更易于發生轉移，是預后不佳的指標。

同時，在單因素生存分析中我們也發現了APE1、VEGF低表達者均較高表達者具有更長的生存期（P=0.003和P=0.009），但進一步將各危險因素帶入COX模型進行多因素分析則發現APE1表達是影響NSCLC患者預后的獨立因素，而在小樣本調查中一些學者亦認為VEGF并不一定成為NSCLC的獨立預后因素，但可能和其他預后因素互相影響[15]，與我們的實驗結論不盡相同。這說明APE1的過表達提示NSCLC患者的預后不佳，而其促進血管生成以及和VEGF表達的相關性則是可能的通路之一。

本研究表明在NSCLC中，APE1與VEGF的表達存在相關性，APE1過表達可能促進腫瘤組織血管的生成，從而導致患者預后不良。同時，APE1作為多功能的生物大分子，仍可能存在其他通路影響惡性腫瘤生長和轉移，值得我們進一步研究，而以之為靶點的治療亦可能是未來的研究方向。

［1］ Puglisi F,Barbone F,Tell G,et al.Prognostic role of Ape/Ref-1subcellularexpressioninstageI-IIIbreastcarcinomas[J].OncolRep, 2002,9(1):11

［2］ Ouellet V,Le Page C,Guyot MC,et al.SET complex in serous epithelial ovarian cancer[J].Int J Cancer,2006,119(9):2119

［3］ Al-Attar A,Gossage L,Fareed KR,et al.Human apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE1)is a prognostic factor in ovarian,gastro-oesophageal and pancreatico-biliary cancers[J].Br J Cancer, 2010,102(4):704

［4］ Wang D,Zhong ZY,Li MX,et al.Vector-based Ape1small interfering RNA enhances the sensitivity of human osteosarcoma cells to endostatin in vivo[J].Cancer Sci,2007,98(12):1993

［5］ Yang ZZ,Chen XH,Wang D.Experimental study enhancing the chemosensitivity of multiple myeloma to melphalan by using a tissue-specific APE1-silencing RNA expression vector[J].Clin Lymphoma Myeloma,2007,7(4):296

［6］ Wang D,Xiang DB,Yang XQ,et al.APE1overexpression is associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and targeted inhibition of APE1enhances the activity of cisplatin in A549cells[J].Lung Cancer,2009,66(3):298

［7］ 王忱，趙曉輝，史玉榮，等.APE1與P-gp在晚期非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義[J].實用癌癥雜志，2010,25(2):146

［8］ 楊玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發病死亡的估計與預測[J].中國衛生統計，2005,22(4):218

［9］ Evans AR,Limp-Foster M,Kelley MR.Going APE over ref-1[J]. Mutat Res,2000,461(2):83

［10］Luo M,Delaplane S,Jiang A,et al.Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1in cancer and endothelial cells:small-molecule inhibition of the redox function of Ape1[J].Antioxid Redox Signal,2008,10(11):1853

［11］Korpanty G,Smyth E,Sullivan LA,et al.Antiangiogenic therapy in lung cancer:focus on vascular endothelial growth factor pathway [J].Exp Biol Med(Maywood),2010,235(1):3

［12］Yoo DG,Song YJ,Cho EJ,et al.Alteration of APE1/ref-1expression in non-small cell lung cancer:the implications of impaired extracellular superoxide dismutase and catalase antioxidant systems[J].Lung Cancer,2008,60(2):277

［13］Ziel KA,Campbell CC,Wilson GL,et al.Ref-1/Ape is critical for formation of the hypoxia-inducible transcriptional complex on the hypoxic response element of the rat pulmonary artery endothelial cell VEGF gene[J].FASEB J,2004,18(9):986

［14］Jackson AL,Zhou B,Kim WY.HIF,hypoxia and the role of angiogenesis in non-small cell lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14(10):1047

［15］Ozbudak IH,Ozbilim G,Kucukosmanoglu I,et al.Vascular endothelial growth factor expression and neovascularization in nonsmall cell lung carcinoma[J].Int J Surg Pathol,2009,17(5):390