微結(jié)構(gòu)芯片對(duì)石墨粉吸附及3種口腔微生物黏附行為的影響

邱瑜蕾 周學(xué)東 包崇云

（1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041；

2.蘇州市華夏口腔醫(yī)院，蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 牙體牙髓科，蘇州 215002）

微結(jié)構(gòu)芯片對(duì)石墨粉吸附及3種口腔微生物黏附行為的影響

邱瑜蕾1，2周學(xué)東1包崇云1

（1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041；

2.蘇州市華夏口腔醫(yī)院，蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 牙體牙髓科，蘇州 215002）

目的 通過制備精確控制微結(jié)構(gòu)的材料樣品，比較不同尺寸無生命物質(zhì)的吸附行為及不同尺寸微生物的黏附行為，探討微結(jié)構(gòu)影響微生物黏附增殖的機(jī)制。方法 聚二甲基硅氧烷（PDMS）翻制羥磷灰石（HA）芯片上的23個(gè)微結(jié)構(gòu)，并分別與不同尺寸的石墨粉和不同尺寸的口腔微生物共培養(yǎng)，觀察并比較微結(jié)構(gòu)大小及形狀對(duì)石墨粉吸附和微生物黏附的影響。結(jié)果 30～50μm的石墨粉在各尺寸微結(jié)構(gòu)上的吸附量無顯著差異，10～20μm的石墨粉在10μm和20μm的結(jié)構(gòu)上吸附量最多；白假絲酵母菌最易黏附于尺度與其大小相當(dāng)?shù)?μm微結(jié)構(gòu)區(qū)。微結(jié)構(gòu)對(duì)呈鏈狀生長(zhǎng)的變異鏈球菌黏附影響不大。結(jié)論 微結(jié)構(gòu)對(duì)無生命物質(zhì)的吸附與二者的尺度大小呈正相關(guān)，對(duì)微生物的黏附也產(chǎn)生同樣影響，即與大小尺度呈正相關(guān)性；但一些特殊增殖行為的細(xì)菌，如呈鏈狀生長(zhǎng)的變異鏈球菌，微結(jié)構(gòu)形狀及尺度大小對(duì)其黏附影響較小。

微結(jié)構(gòu)芯片； 石墨粉； 口腔微生物

種植義齒是采用人工種植體植入頜骨獲取固位支持的修復(fù)體，與傳統(tǒng)義齒比較具有固位好、咀嚼效率高、美觀舒適等特點(diǎn)。實(shí)際應(yīng)用中，細(xì)菌在基樁表面的初期黏附與隨后的大量增殖引起的種植體周圍炎是該類義齒的主要并發(fā)癥[1]。因此要保證種植體長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用成功，促進(jìn)軟組織封閉及阻止細(xì)菌在基樁表面的黏附與增殖是非常重要的。理想的種植體穿黏膜部分的表面應(yīng)該不僅允許上皮和結(jié)締組織附著，而且應(yīng)該同時(shí)把細(xì)菌黏附降到最小程度。種植體穿齦部位的化學(xué)組成、表面物理形貌決定細(xì)菌及軟組織的黏附及附著行為，并影響軟組織與植入體間密封[2-5]。關(guān)于物理形貌，多數(shù)學(xué)者主張?jiān)摬课粦?yīng)具有相對(duì)光潔的表面，但什么特征的表面形貌結(jié)構(gòu)利于軟組織生物密封目前不清。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞易于在亞微米結(jié)構(gòu)附著、增殖，細(xì)菌易于在微米結(jié)構(gòu)黏附、增殖。但究竟是細(xì)胞、細(xì)菌自身尺寸大小影響了它們對(duì)不同尺度結(jié)構(gòu)的附著和黏附，還是因?yàn)樗鼈兙哂胁煌纳飳W(xué)行為目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇將無生物學(xué)行為的無生命微粒在微結(jié)構(gòu)上的吸附行為與有生物學(xué)行為的微生物在微結(jié)構(gòu)上的黏附行為進(jìn)行比較，探究微生物本身的物理特性和生物學(xué)特性對(duì)其黏附行為的影響情況，初步探討優(yōu)化種植體頸部光滑表面特性的可行辦法。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）芯片（由荷蘭的屯特大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）試劑（SYLGARD-184，美國道康寧公司），石墨粉（青島申墅石墨制品有限公司），變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）ATCC 25175、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）ATCC 6538和白假絲酵母菌（Saccharomyces albicans，S.albicans）ATCC 10231標(biāo)準(zhǔn)菌株（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物教研室提供），85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠），SW-CJ-ZF超凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司），HITACHI53400掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，SEM）（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 微米結(jié)構(gòu)芯片樣品的制備 HA芯片是規(guī)則地劃分有23個(gè)大小為400μm×400μm微結(jié)構(gòu)的HA芯片，其中1個(gè)區(qū)域?yàn)閷?duì)照，其余尺度分為1、3、5、10μm[6]；深度與制備尺度相當(dāng)；微結(jié)構(gòu)間的間距分別有10和20μm兩種；形狀為線條、交叉線條、圓孔和三角形的微結(jié)構(gòu)。首先將PDMS與促凝劑按10∶1調(diào)合，傾倒入裝有HA微結(jié)構(gòu)芯片的培養(yǎng)皿中，負(fù)壓抽吸去除其內(nèi)氣泡，置于70℃烘箱內(nèi)1 h，即翻制形成陰模。陰模表面噴金，再用PDMS翻模，最終形成與HA微結(jié)構(gòu)模式一致的微結(jié)構(gòu)芯片樣品。用SEM分析PDMS翻制的陰、陽模樣品微結(jié)構(gòu)形貌。

1.2.2 微米結(jié)構(gòu)芯片對(duì)石墨粉吸附行為的影響 電子稱稱量粒度分別為1、10～20、30～50μm的石墨粉（由于超微粒制作工藝的因素，本實(shí)驗(yàn)中所指1μm微粒實(shí)際尺度其實(shí)小于等于1μm），并用蒸餾水配制質(zhì)量/體積比為1∶80 000的懸濁液，磁力攪拌器攪拌30min見懸濁液混合均勻后，放入模型，靜置于37℃培養(yǎng)箱中，30min后取出。用PBS液沖洗3～4次，晾干后光鏡及SEM下觀察。

1.2.3 微米結(jié)構(gòu)芯片對(duì)3種微生物黏附行為的影響菌種復(fù)蘇后，用廣口燒瓶對(duì)PDMS材料樣品與細(xì)菌懸濁液培養(yǎng)，S.mutans、S.albicans及S.aureus的接種數(shù)量分別為1.8×109、8.5×108和1.8×108CFU·mL-1。分別培養(yǎng)48 h及72 h后，處理樣本后在SEM下觀察細(xì)菌黏附情況，并定量計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，取得均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制柱形圖。因有尺寸和間隔距離的變化，對(duì)同一形狀的微結(jié)構(gòu)可進(jìn)行兩因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PDMS模型SEM分析

PDMS模型SEM分析圖見圖1，用模子復(fù)制技術(shù)在PDMS這種高分子材料上可制造與母模相同的清晰的微米結(jié)構(gòu)，為下一步實(shí)現(xiàn)高通量篩選分析微結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌行為影響方面的研究提供高效廉價(jià)的樣本。

圖1 翻制的PDMS模型上的三角形（A）、直線形（B）、圓形（C）和交叉形（D）微結(jié)構(gòu)Fig 1 Triangle（A）,linear form（B），round（C）and cross-shaped（D）microstructures on the PDMSmodel

2.2 石墨粉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

30～50μm的石墨粉在陰模與陽模上吸附量差異不大（圖2）。10～20μm石墨粉在陰模上吸附量多于陽模（圖2）。1μm石墨粉在空白對(duì)照區(qū)吸附量最大（圖3），說明超微粒具有極強(qiáng)的吸附性，容易成團(tuán)簇性吸附于空間區(qū)域較大的地方。

2.3 口腔微生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

S.albicans在有微結(jié)構(gòu)的區(qū)域，菌細(xì)胞優(yōu)先聚集在溝槽、凹陷內(nèi)，因不同形狀的微結(jié)構(gòu)排列成團(tuán)塊狀、串珠狀等；而且，細(xì)菌最容易黏附生長(zhǎng)于尺度與其大小最接近的5μm的微結(jié)構(gòu)中（圖4）。S.mutans在材料上的黏附量比其他菌種顯著減少，細(xì)菌成短鏈狀生長(zhǎng)在模型的各個(gè)區(qū)域，不受微結(jié)構(gòu)的形狀影響。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在空白區(qū)黏附增殖量明顯多于微結(jié)構(gòu)區(qū)（圖5）。S.aureus在較小微結(jié)構(gòu)中呈單個(gè)散在分布，微結(jié)構(gòu)尺寸與細(xì)菌相當(dāng)時(shí)，菌量最多；在空間較大的結(jié)構(gòu)區(qū)，菌細(xì)胞優(yōu)先成葡萄串珠樣或團(tuán)塊狀聚集，且隨著微結(jié)構(gòu)尺寸的增大，菌量增加。

圖2 10～20μm的石墨粉在各微結(jié)構(gòu)上的吸附量（上）；30～50μm的石墨粉在各微結(jié)構(gòu)上的吸附量（下）Fig 2 Adsorption of 10-20μm graphite powder on differentmicrostructures（up）.Adsorption of 30-50μm graphite powder on different microstructures（down）

圖3 1μm的石墨粉在各結(jié)構(gòu)上的吸附量Fig 3 Adsorption of 1μm graphite powder on different structures

圖4 S.albicans在各微結(jié)構(gòu)上的黏附量Fig 4 Adsorption of S.albicans on different microstructures

圖5 S.mutans在各微結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)不同時(shí)間的黏附量Fig 5 Adsorption of S.mutans on different microstructures cultured by different times

3 討論

生物材料的表面特性（包括物理形貌和化學(xué)組分）決定著細(xì)胞和細(xì)菌的附著和黏附[7-10]。光滑的基樁表面有利于減少細(xì)菌的黏附，但并非越光滑越好，因?yàn)樘^光滑的基樁表面并不利于軟組織的附著并形成良好的生物封閉。已有研究[11]表明：如果表面特征尺寸遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于微生物尺寸，則不會(huì)有明顯的微生物滯留；但是如果兩者尺寸相當(dāng)，那么微生物的滯留量就會(huì)增加?；诖耍緦?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了多種形狀、不同尺寸的微米結(jié)構(gòu)來初步觀察口腔微生物的黏附是否受特征結(jié)構(gòu)的形狀和大小的影響，并將其與無生物學(xué)行為的微粒的吸附行為進(jìn)行比較，以探討生物學(xué)行為在微生物黏附中的特殊作用。

用于微結(jié)構(gòu)研究的基質(zhì)包括陶瓷、硅、玻璃或者高分子材料等。本實(shí)驗(yàn)的母模以HA為基質(zhì)，因?yàn)镠A具有良好的生物相容性，不僅廣泛用于穿皮/穿齦植入式器件的骨內(nèi)段，同時(shí)也用于基樁部分的制作。但由于本實(shí)驗(yàn)需要很多樣本，而在HA上激光消融制作微結(jié)構(gòu)耗時(shí)耗力，因此選用高分子材料PDMS來翻制HA芯片，模擬基樁表面微結(jié)構(gòu)。PDMS不但具有良好的生物相容性，低毒性，高氧化性和熱穩(wěn)定性，并且廉價(jià)，彈性、流動(dòng)性和操作性能好，可以精確翻制HA模型上的微結(jié)構(gòu)，另外它的透明材質(zhì)方便在光鏡下做初步模型觀察和篩選。

在種植體的臨床應(yīng)用中，基樁周圍組織感染是最常見的并發(fā)癥[12]。口內(nèi)穿齦器件周圍感染時(shí)，檢測(cè)出的細(xì)菌以厭氧菌為主[13]。本實(shí)驗(yàn)的研究菌株既要考慮其在口腔環(huán)境中的致病性，又要考慮菌體大小差異以比較不同大小的細(xì)菌對(duì)不同尺寸的微結(jié)構(gòu)的黏附有無差異；因此，本實(shí)驗(yàn)選擇口內(nèi)的主要致病菌S.mutans（直徑0.5～0.75μm）以及與其體積相差較大的口腔常見致病真菌S.albicans（直徑2～4μm）。此外，由于S.mutans成鏈狀生長(zhǎng)，為了減少生長(zhǎng)特性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，故設(shè)金黃色葡萄球菌為另一實(shí)驗(yàn)對(duì)象以作對(duì)比。本實(shí)驗(yàn)中，3種微生物的初始密度（S.mutans1.8×109、S.albicans8.5×108、S.aureus1.8× 108CFU·mL-1）是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的最佳密度。由于本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行同種微生物間的比較，所以三者初始數(shù)據(jù)雖不一致，但并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。究其原因，S.mutans為厭氧菌，較為脆弱，所以密度最大；而S. albicans為真菌，增殖速度較慢，在培養(yǎng)相同時(shí)間的前提下，只有增加密度才能得到較滿意的增殖量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)無生命微粒尺度遠(yuǎn)大于微結(jié)構(gòu)時(shí)，后者對(duì)前者的吸附?jīng)]有顯著影響；大于1μm的微粒最易吸附于大小與其相當(dāng)?shù)奈⒔Y(jié)構(gòu)中，而小于1μm的微粒因其獨(dú)特的超強(qiáng)吸附性，最易成團(tuán)簇狀吸附于空間較大的區(qū)域。成散在單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)菌最易黏附于尺度與其大小相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)區(qū)；而成團(tuán)狀生長(zhǎng)的葡萄球菌，容易黏附增殖于空間大的區(qū)域。微結(jié)構(gòu)對(duì)非生命物質(zhì)的吸附與二者的尺度大小呈正相關(guān)性，對(duì)微生物的黏附、增殖也產(chǎn)生同樣影響，即與大小尺度呈正相關(guān)性；但一些特殊增殖行為的細(xì)菌，如呈鏈狀生長(zhǎng)的S.mutans微結(jié)構(gòu)，微結(jié)構(gòu)形狀及尺度大小對(duì)其黏附、增殖影響較小。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)單種菌生長(zhǎng)時(shí)的黏附情況進(jìn)行了觀察，而口腔中牙菌斑生物膜是以生態(tài)群體的形式存在，各種細(xì)菌之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系（如共生與競(jìng)爭(zhēng)、依存與拮抗等），它們也影響著細(xì)菌的黏附和增殖。因此，下一步實(shí)驗(yàn)需選取多種種植體周炎的可疑致病菌共同培養(yǎng)，更加真實(shí)地模擬口腔細(xì)菌定植和增殖的群體模式，制作種植體頸部環(huán)形結(jié)構(gòu)的HA模型，以期實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近臨床環(huán)境的真實(shí)情況，進(jìn)一步探討細(xì)菌引起種植體周炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

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（本文編輯 湯亞玲）

Influence of m icro-pattern on adherence of graphite powder and three kinds of oral m icrobes

QIU Yulei1，2,ZHOU Xue-dong1,BAO Chong-yun1.（1.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China;2.Dept.of Endodontics,Suzhou Huaxia Stomatological Hospital,Suzhou Health College,Suzhou215002,China）

ObjectiveTrying to find out the mechanism of microstructure influencing bacterial adhesion,we prepared different microstructures to compare the adsorptive behavior of graphite powder and adhesive behavior of oral microbe.MethodsWe used polydimethylsiloxane（PDMS）to copy 23 microstructures of hydroxyapatite（HA）chip,and cultured them with different sizes graphite powder and oralmicrobes respectively,to observe and compare their behavior on microstructures.Results The adsorption of 30-50μm powder on different microstructures was insignificant,while 10-20μm powder had maximum adsorption on 10μm and 20μm microstructures.Saccharomyces albicanswas most likely to adhere to 5μm microstructures which was equivalent to its own size.However,microstructures had little effect on adhesion ofStreptococcusmutanswhich grew in a chain.ConclusionThe size ofmicrostructure was themost effective factor that affects the adsorption of non-living powder,and it also had the same effect on the microbial adhesion;but some special bacteria,such asStreptococcus mutanswhich grew in a chain,was not affected by the sizes or shapes of microstructures.

micro-pattern chip； graphite powder； oral microbe

R 783.1

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.026

1000－1182（2011）03－0323-04

2010-10-27；

2011-02-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30970728）

邱瑜蕾（1985—），女，浙江人，助教，碩士

包崇云，Tel：028-85501233