信號轉導蛋白P65與放療誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的關系

馬利 張東升 吳軍樓 韓俊慶 張世周 劉桂軍 牟文麗 張捷

（1.山東大學附屬省立醫院 口腔頜面外科；

2.腫瘤研究治療中心；3.臨床科研中心，濟南 250021）

信號轉導蛋白P65與放療誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的關系

馬利1張東升1吳軍樓1韓俊慶2張世周1劉桂軍1牟文麗3張捷3

（1.山東大學附屬省立醫院 口腔頜面外科；

2.腫瘤研究治療中心；3.臨床科研中心，濟南 250021）

目的 探討不同劑量的X射線對口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞中信號轉導蛋白P65表達的影響以及P65與放療誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的關系。方法 人舌鱗癌Tca8113細胞復蘇后，在37℃，5%CO2的孵箱中培養。共分對照組、2、4、6、8、10Gy劑量組，待細胞長至對數生長期后，對細胞分別應用上述照射劑量一次性照射。照射后繼續培養，并在照射后的不同時間點（1、3、6、10、24、48 h）應用免疫細胞化學和Western blot檢測細胞中P65的表達量，并同時應用流式細胞儀和末端核苷酸轉移酶介導的生物素化的dUTP末端標記（TUNEL）法檢測不同X射線劑量組的細胞凋亡率。結果 不同X射線劑量組的細胞漿內P65蛋白的表達量與對照組相比差異均具有統計學意義（P＜0.05），而不同時間點組的細胞漿內P65蛋白表達量相互比較，3 h組的細胞漿內P65蛋白表達量與其他時間點組相比差異有顯著性（P＜0.05）。不同劑量組的凋亡率與對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05），而不同時間點組的凋亡率相互比較時，3 h組的凋亡率與其他時間點組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 X射線可以激活口腔鱗狀細胞癌細胞中核因子-κB（NF-κB）P65信號轉導通路，而P65在細胞漿中表達與放療誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡具有正相關性，激活后進入細胞核內的P65蛋白可能具有抵抗細胞凋亡的作用。

P65； 口腔鱗狀細胞癌； 細胞凋亡

在中國，口腔頜面部-頭頸癌約占全身惡性腫瘤的5.6%，其中口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是最常見的類型，占該部位腫瘤的80%[1]。據目前的統計，經過手術和放療為主的綜合治療后，口腔頜面部鱗癌患者5年生存率達到65%左右，但對晚期患者，盡管輔以放療、化療和生物治療的綜合治療手段，5年生存率僅為20%～40%，尚不能令人滿意[2]。細胞凋亡是放射線所致細胞死亡的形式，因此腫瘤細胞的凋亡有可能成為預測腫瘤放療敏感性的指標之一。

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是與免疫球蛋白的輕鏈基因增強子κB序列（GGGACTTTCC）特異結合的核轉錄因子，在細胞的增殖調控和凋亡過程中起重要的作用[3]。因此本課題采用Tca8113細胞，通過研究X射線對口腔鱗狀細胞癌細胞中NF-κB P65信號轉導通路的激活作用以及放射線誘導口腔鱗狀細胞癌細胞的凋亡變化，旨在探討P65在放射線誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡中的變化，為進一步揭示其在放射線誘導腫瘤細胞凋亡中的作用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

實驗所需舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面腫瘤生物實驗室提供；胎牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640（Hyclone公司，美國），NF-κB P65單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），免疫組織化學試劑盒、DAB顯示液（購自北京中杉金橋生物技術有限公司），細胞裂解液、蛋白濃度測定試劑盒（購自上海申龍博彩生物技術有限公司），β-actin（Santa Cruz公司，美國），鼠抗人二抗（Santa Cruz公司，美國），流式細胞儀（Sony公司，日本），Annexin V/FITC和PI雙染標記試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），TUNEL試劑盒（Roche公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及傳代 復蘇Tca8113細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養，待細胞生長至80%時，用0.25%胰酶和0.2%EDTA以1∶1的體積比混合消化細胞，傳代培養。

1.2.2 細胞照射 將細胞分為6個實驗組，待細胞長至對數生長期后，對細胞進行照射，照射后繼續在37℃、5%CO2的孵箱中培養。照射機器用山東大學附屬省立醫院腫瘤研究治療中心德國西門子PRIMUSH醫用直線加速器。照射時在細胞培養瓶上方覆蓋約1 cm厚的濕潤棉紗，以相當于腫瘤表面的正常組織厚度。

1.2.3 免疫細胞化學檢測 細胞照射后的1、3、6、10、24、48h在無菌條件下分別自培養瓶中取出細胞爬片，用4%的多聚甲醛固定，并用2%的Triton X-100處理細胞，應用正常血清封閉10min后加入一抗，4℃冰箱過夜，第2天加入二抗后室溫孵育20min，以上每步完成后應用PBS液沖洗5min×3次。DAB顯色劑顯色后應用中國樹膠封片，并分別在每個實驗組的每張切片上隨機選擇4個部位拍攝圖片，并測其平均灰度值。

1.2.4 Western blot檢測 在照射后不同時間點分別對每個劑量組細胞進行收集，對細胞進行裂解，裂解后4℃ 20 000 r·min-1高速離心10min，收集上清液于無菌EP管中，應用BCA法測試蛋白的濃度，并將蛋白樣品于-80℃凍存備用。蛋白變性后按上樣量20μg上樣，電泳，轉膜后加入一抗（濃度為1∶1 000），4℃冰箱孵育過夜，用1×TBST溶液洗膜3次，加入二抗（濃度為1∶5000）后室溫孵育1h，暗室曝光顯影。用圖像分析儀定量細胞P65含量的灰度值。

1.2.5 流式細胞儀檢測 照射后的不同時間點分別對每個劑量組細胞進行收集，用PBS洗細胞2次，用結合緩沖液重懸細胞，向反應管中加入Annexin V/FITC 5μL和PI 10μL，混勻后于室溫避光孵育15min；孵育完成后分別在反應管中加入400μL 1×結合緩沖液，上機檢測細胞的凋亡率。

1.2.6 TUNEL法檢測 制作細胞爬片，細胞照射后的1、3、6、10、24、48 h在無菌條件下分別自培養瓶中取出細胞爬片，用4%的多聚甲醛室溫固定1 h；加封閉液室溫孵育10min；打孔液在冰上孵育2min；加入TUNEL混合反應液，37℃避光孵育60min；然后加入Converter-POD，37℃孵育30min；最后加入DAB顯色液顯色，室溫孵育10min；以上每步完成后均用PBS漂洗，3次共15min，吸去多余的水分，自然晾干，中國樹膠封片。分別在每個實驗組的每張切片上隨機選擇4個部位拍攝圖片，計算其凋亡率。

1.2.7 數據分析 應用SPSS 13.0軟件包對實驗數據進行方差分析。

2 結果

2.1 免疫細胞化學檢測細胞中NF-κB P65表達的變化情況

NF-κB P65免疫細胞化學陽性染色呈棕褐色細顆粒狀，主要定位于腫瘤細胞的胞漿中，以染色的深淺代表陽性的程度。在對照組的Tca8113細胞中，胞漿著色明顯，胞核無明顯著色，而隨著照射劑量的增加，NF-κB P65在胞核中的染色逐漸深染（圖1）。X射線照射細胞后，NF-κB P65在細胞漿中的表達量減少，其平均灰度值也相應降低，2、4、6、8、10Gy組與對照組的平均灰度值進行統計學檢驗，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。而不同時間點的平均灰度值相互比較，統計檢驗結果顯示：3 h組的平均灰度值與其他時間點相比差異有顯著性（P＜0.05，表1）。

圖1 不同實驗組Tca8113細胞的染色情況 倒置顯微鏡 ×400Fig 1 The staining in various groups of Tca8113 cells inverted microscope ×400

表1 不同劑量組在照射后不同時間點測得Tca8113細胞灰度值Tab 1 Com parsion of Tca8113 cells between different dose groups and different time groups

2.2 Western blot檢測細胞中NF-κB P65表達的變化情況

對照組中應用X射線照射細胞后各時間點的P65蛋白表達量無明顯變化，而不同劑量組照射后細胞漿中的P65蛋白表達量均出現明顯的變化，因此胞漿中P65蛋白的表達變化在一定程度上反映了細胞核中P65蛋白表達的多少，并且不同劑量組NF-κB P65蛋白表達量的平均值與對照組相比均具有統計學意義（P＜0.05），同樣，不同時間點其表達量的平均值相互比較，3 h組蛋白表達平均值與其他時間點相比差異有顯著性，具有統計學意義（P＜0.05），與免疫細胞化學檢測到的結果一致（圖2）。

圖2 Western blot檢測不同實驗組Tca8113細胞漿中P65含量的變化Fig 2 Change of P65 of Tca8113 cells in various groups cytoplasm with Western blot

2.3 流式細胞儀和TUNEL法檢測細胞的凋亡率

用X射線激活Tca8113細胞中的NF-κB信號轉導通路后，用流式細胞儀和TUNEL法檢測細胞凋亡率，凋亡曲線如圖3、4所示。而TUNEL法檢測到的陽性細胞散在分布，胞核或胞質同時呈棕黃色，有典型凋亡細胞形態特征，與周圍細胞分離，胞體較小，染色質沿核膜呈規則半月形邊集或碎裂或形成凋亡小體，其凋亡細胞的多少與放射線的劑量和時間有依賴關系（圖5）。流式細胞儀和TUNEL法分別檢測的不同劑量組的細胞凋亡率與對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05），而將不同時間點組的平均細胞凋亡率相互比較后發現，3 h組的凋亡率與其他時間點組相比有統計學意義（P＜0.05），其變化與細胞漿中NF-κB P65信號轉導蛋白的表達變化趨勢一致。

圖3 流式細胞儀檢測Tca8113細胞的凋亡曲線Fig 3 The cell apoptosis curve of Tca8113 cells by flow cytometer

圖4 TUNEL法檢測Tca8113細胞的凋亡曲線Fig 4 The cell apoptosis curve of Tca8113 cells by TUNEL

圖5 Tca8113細胞凋亡圖像 TUNEL ×400Fig 5 The cell apoptosis figure of Tca8113 cells TUNEL ×400

3 討論

3.1 X射線對NF-κB P65信號轉導通路的影響

目前在哺乳類動物中發現的NF-κB/Rel蛋白主要有5種：RelA（P65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50）、NF-κB（p52），它們均以同源或異源二聚體的形式存在細胞質中，其中最主要的是P65/P50異源二聚體[4]。研究表明許多因素如細菌、病毒、真菌、炎癥因子、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），氧化應激反應，紫外線以及治療用藥物等均可以激活NF-κB P65信號轉導通路[5]。NF-κB通過3種途徑活化，其中2條途徑是IκB激酶依賴的，另一條途徑與酪蛋白激酶2有關，活化后的NF-κB進入細胞核中，可與相關基因啟動子和增強子特殊DNA序列結合，調控凋亡相關基因、原癌基因以及腫瘤轉移相關黏附分子、細胞外基質水解酶等多種基因的表達[6]。

Ramanan等[7]研究發現：在嚙齒類動物中，放射線可以通過激活NF-κB P65信號轉導通路而引起小神經膠質細胞的損傷；Fan等[8]同樣應用放射線激活了小鼠皮膚表皮細胞的NF-κB信號轉導通路；而本課題組先前的課題[9]研究也發現：應用X射線可以激活ACC-2細胞中的NF-κB P65信號轉導通路。本實驗應用不同劑量X射線一次性照射Tca8113細胞后，應用免疫細胞化學和Western blot均檢測到了NF-κB P65信號轉導蛋白在細胞漿中的表達變化，分析后發現此信號轉導蛋白的表達具有時間和劑量依賴性，不同劑量組X射線P65的表達高峰是不一樣的。目前臨床上應用最廣泛的放射治療方法為常規分割放射治療和非常規放射治療，也即采用的均是連續多次照射。而本實驗所采用的照射劑量均是一次性照射，因此一次性照射與連續性多次照射對此信號轉導通路的影響是否一致還有待進一步的研究。

3.2 NF-κB P65在放射線誘導細胞凋亡中的變化

放射線誘導腫瘤細胞凋亡是放射治療的主要機制之一，與腫瘤組織細胞放射敏感性或放射抗性有關。現代研究發現：放療過程中可見大量具有凋亡特征的癌細胞。細胞凋亡是一個由多基因參與的細胞主動自殺過程，不同誘發因素經不同信號途徑，將細胞外信號轉導至細胞內，激活凋亡基因，進而激活各種蛋白酶降解各自的底物，導致凋亡發生。在腫瘤的放射治療中，腫瘤細胞受照射后，DNA受損而發生單鏈斷裂，而且核酸內切酶活性升高，使DNA單鏈斷裂變為雙鏈斷裂，誘發凋亡[10]。

研究[11]發現：NF-κB在調節細胞凋亡中起著重要作用。激活后的NF-κB進入細胞核中與特異的DNA序列結合，從而參與在抗凋亡、細胞周期和細胞間黏附中起重要意義基因的轉錄調控，放射線和一些細胞毒性藥物可激活NF-κB，抑制NF-κB可減少腫瘤的生長，并提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物和放射線介導的凋亡敏感性。Beg等[12]通過檢測敲除NF-κB P65亞單位的大鼠肝臟后發現：缺失P65亞單位大鼠的大量肝臟細胞出現凋亡。以后越來越多證據進一步證明了NF-κB對輻射的抗凋亡活性，激活NF-κB可以阻斷輻射誘導的凋亡過程。而Chen等[13]應用去甲斑蝥素激活HepG2細胞中NF-κB信號通路后可以誘導細胞凋亡，可見激活后的NF-κB具有促進或抑制細胞凋亡的作用，此可能與誘導物或細胞類型有關。

本課題將流式細胞儀及TUNEL檢測方法聯合應用來檢測不同劑量X射線誘導口腔鱗狀細胞癌細胞的凋亡率。實驗研究發現細胞經過不同劑量X射線照射后，與對照組相比均出現了細胞凋亡率的增加，且在不同的時間點其凋亡率也是不同的；各時間點組的平均凋亡率相比發現：3 h組的平均凋亡率更具有統計學意義，這與本課題組前期已經證實的不同劑量X射線照射口腔鱗狀細胞癌細胞后NF-κB P65信號轉導蛋白在細胞漿中的表達變化是一致的。由于對照組中P65蛋白在胞漿中表達無明顯變化，因此胞漿中P65蛋白的表達變化在一定程度上也反應了細胞核中P65蛋白表達的多少，因此推測激活后進入細胞核中的NF-κB P65信號轉導蛋白表達量的多少可能與X射線誘導Tca8113細胞凋亡有關，但其具體作用還有待進一步研究證實。

[1] 卞金友.口腔預防醫學[M].北京：人民衛生出版社,2000：40-41.

BIAN Jin-you.Stomatological preventivemedicine[M].Beijing：People’s Medical Publishing House,2000：40-41.

[2] 邱蔚六,張志愿.口腔頜面腫瘤學[M].濟南：山東科學技術出版社,2004：1-11.

QIU Wei-liu,ZHANG Zhi-yuan.Oral and maxillofacial oncology [M].Jinan：Shandong Science and Technique Press,2004：1-11.

[3] Pande V,Sharma RK,Inoue J,et al.A molecular modeling study of inhibitors of nuclear factor kappa-B（p50）—DNA binding[J]. J Comput Aided Mol Des,2003,17（12）：825-836.

[4] Delhalle S,Blasius R,Dicato M,et al.A beginner’s guide to NF-kappaB signaling pathways[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1030：1-13.

[5] Xiao G,Rabson AB,Young W,et al.Alternative pathways of NF-kappaB activation：A double-edged sword in health and disease [J].Cytokine Growth Factor Rev,2006,17（4）：281-293.

[6] Salminen A,Huuskonen J,Ojala J,et al.Activation of innate immunity system during aging：NF-kB signaling is the molecular culprit of inflamm-aging[J].Ageing Res Rev,2008,7（2）：83-105.

[7] Ramanan S,Kooshki M,Zhao W,et al.PPARalpha ligands inhibit radiation-induced microglial inflammatory responses by negatively regulating NF-kappaB and AP-1 pathways[J].Free Radic Biol Med, 2008,45（12）：1695-1704.

[8] Fan M,Ahmed KM,Coleman MC,et al.Nuclear factor-kappaB and manganese superoxide dismutase mediate adaptive radioresistance in low-dose irradiated mouse skin epithelial cells[J].Cancer Res,2007,67（7）：3220-3228.

[9] 劉桂軍,張東升,韓俊慶,等.放療對人唾液腺腺樣囊性癌p65信號傳導通路的影響[J].中國口腔頜面外科雜志,2006,4（5）：361-365.

LIU Gui-jun,ZHANG Dong-sheng,HAN Jun-qing,et al.The effect of radiotherapy on p65 signal conduct access of adenoid cystic carcinoma cell[J].Chin JOral Maxillofac Surg,2006,4（5）：361-365.

[10]Meyn RE,Milas L,Ang KK.The role of apoptosis in radiation oncology[J].Int J Radiat Biol,2009,85（2）：107-115.

[11] Yeoh A,Gibson R,Yeoh E,et al.Radiation therapy-induced mucositis：Relationships between fractionated radiation,NF-kappaB,COX-1,and COX-2[J].Cancer Treat Rev,2006,32（8）：645-651.

[12] Beg AA,Sha WC,Bronson RT,et al.Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappaB[J].Nature,1995,376（6536）：167-170.

[13] Chen YN,Cheng CC,Chen JC,et al.Norcantharidin-induced apoptosis is via the extracellular signal-regulated kinase and c-Jun-NH2-terminal kinase signaling pathways in human hepatoma HepG2 cells[J].Br J Pharmacol,2003,140（3）：461-470.

（本文編輯 湯亞玲）

Relationship between P65 and radiotherapy-induced oral squamous cell carcinoma cell line apoptosis

MA Li1,ZHANG Dong-sheng1,WU Jun-lou1,HAN Jun-qing2,ZHANG Shi-zhou1,LIU Gui-jun1,MU Wen-li3,ZHANG Jie3.（1.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan250021，China; 2.Cancer Center,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan250021,China;3.Medical Research Center,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan250021,China）

ObjectiveTo investigate the effects of different X-ray doses on the expression of nuclear factor-κB（NF-κB）P65 in human oral squamous cell carcinoma cell（OSCC）line and the relationship between NF-κB P65 and radiation-induced OSCC cell line apoptosis.MethodsThe squamous cell carcinoma of Tca8113 cell was cultivated in the 37℃,5%CO2incubator after recovery.The experiment samples were divided into six groups（control group,2,4, 6,8,10 Gy）.After growing to logarithm period,Tca8113 cells were irradiated using above-mentioned X-ray doses. The immunocyteochemistry and Western blot were used to detect the expression of NF-κB P65 after irradiation in various times（1,3,6,10,24,48 h）.The apoptosis rates under different radiotherapy dose were detected by flow cytometer and TDT-mediated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）.Results Compared with the control group,cytoplasm expression of P65 under different X-ray doses had statistically significant differences（P＜0.05）.While the cytoplasm P65 protein expression at different time were compared each other,the 3 h group demonstrated significant difference（P＜0.05）.Apoptosis rates in various groups,compared with control group,had statistically significant differences（P＜0.05）. While the groups at different time points were compared each other,the apoptosis rates of 3 h group had significant differences（P＜0.05）.ConclusionX-ray can activate the NF-κB P65 in oral squmaous cell carcinoma cell lines.The correlation between expressional quantity of P65 and radiotherapy induced apoptosis of oral squamous cell carcinoma cell lines possesses positive correlation.The activated and intranuclear P65 may have radiotherapy resistant effect.

P65； oral squamous cell carcinoma；cell apoptosis

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.025

1000－1182（2011）03－0318-05

2010-02-17；

2011-03-18

山東省科技攻關基金資助項目（2006GG20002046）

馬利（1983—），男，山東人，碩士

張東升，Tel：0531-85186950