環孢素對大鼠牙齦上皮細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

劉培紅 馬肅 陳力

（1.哈爾濱醫科大學口腔醫院 牙周科；2.哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院 科研科，哈爾濱 150001）

環孢素對大鼠牙齦上皮細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

劉培紅1馬肅1陳力2

（1.哈爾濱醫科大學口腔醫院 牙周科；2.哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院 科研科，哈爾濱 150001）

目的 觀察環孢素（CsP）對大鼠牙齦上皮細胞凋亡活動、凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3表達的影響，探討CsP致牙齦上皮增厚的可能機制。方法 SPF級7周齡雄性Wistar大鼠80只，隨機分為實驗組和對照組，每組又分為10、20、30、40 d亞組，實驗組胃飼含CsP鮮牛奶，對照組胃飼等量鮮牛奶。經心灌注4%多聚甲醛，固定取材，制作下頜第一磨牙頰舌向石蠟切片，原位缺口末端標記（TUNEL）法檢測牙齦上皮細胞原位凋亡，免疫組化PV兩步法檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。利用圖像分析系統計算牙齦上皮細胞凋亡率和Caspase-3蛋白陽性細胞表達率，并測量Bcl-2蛋白平均灰度，行完全隨機分組兩因素析因設計方差分析。結果 實驗組大鼠牙齦上皮內細胞凋亡率和Caspase-3蛋白陽性細胞表達率下調，與對照組有顯著差異（P<0.05）。實驗組大鼠牙齦上皮內Bcl-2蛋白平均灰度上調，與對照組有顯著差異（P<0.05）。結論 環孢素導致牙齦上皮增厚可能與干擾線粒體凋亡途徑、抑制細胞凋亡有關。

環孢素； 藥物性牙齦增生； 細胞凋亡

免疫抑制劑環孢素（Ciclosporin，CsP）可誘導藥物性牙齦增生，影響牙周組織健康和美觀，但CsP誘導牙齦增生的發病機制尚不十分清楚，尤其是CsP對牙齦上皮組織的影響，結論存在分歧[1]。本實驗以大鼠為實驗對象，定量分析CsP對大鼠牙齦上皮細胞凋亡活動、凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3表達的影響，旨在探討CsP致大鼠牙齦上皮增厚可能的發病機制。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑和儀器

CsP（商品名：新山地明，瑞士諾華制藥有限公司）。兔抗鼠Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體（武漢博士德有限公司）；原位缺口末端標記（TdT-mediated dUT nick endlabeling，TUNEL）法檢測試劑盒（美國羅氏公司）；PV兩步法免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Leica DM2500光學顯微鏡（德國萊卡公司），Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統（北京麥克奧迪圖像技術有限公司）。

1.2 動物選擇、分組和建模

選取由哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供的SPF級7周齡雄性Wistar大鼠80只，隨機分為實驗組和對照組，每組又分為10、20、30、40 d亞組，隔離器飼養，正常食水。實驗組胃飼質量濃度為5mg·mL-1的CsP鮮牛奶混濁液，CsP攝入量為每天30mg·kg-1，對照組胃飼不含CsP的等量鮮牛奶。

1.3 取材、TUNEL法及免疫組織化學染色

按實驗設計取材、固定、脫鈣后，以下頜第一磨牙近中面為包埋面常規方法制作下頜磨牙區牙周牙體聯合組織蠟塊，4μm厚頰舌向連續切片。選擇下頜第一磨牙近遠中面中點處組織切片5張，1張行TUNEL法檢測牙齦上皮凋亡細胞，2張行Bcl-2和2張行Caspase-3蛋白的PV兩步法免疫組織化學染色，操作按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定

TUNEL陽性表達呈棕黃色顆粒，定位于胞核內；Caspase-3蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒，定位于胞核內和胞漿內；Bcl-2蛋白陽性表達呈棕褐色顆粒，定位于胞漿內和胞核表面。每張TUNEL和Caspase-3蛋白陽性切片在光鏡下（×400倍）隨機選取上皮內5個陽性表達最多的視野，每個高倍視野計數100個細胞，取平均值記錄凋亡指數（apoptotic index，API）和Caspase-3蛋白陽性細胞表達率。每張Bcl-2蛋白陽性切片在光鏡下（×630倍）隨機選取上皮內5個陽性表達最多的視野，測定Bcl-2蛋白的平均灰度，取其平均值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0統計分析軟件包對各組數值進行完全隨機分組兩因素析因設計資料的方差分析，P< 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL檢測結果

TUNEL陽性細胞定位于口腔齦上皮、溝內上皮和結合上皮。實驗組大鼠牙齦上皮內API在頰側和舌側均顯著小于對照組，各實驗組間API在頰側和舌側均無明顯差異（表1）。

表1 頰側和舌側數據析因統計分析結果P值Tab 1 P value of bucco-lingual data by analysis of variance of factorial design

2.2 Caspase-3蛋白表達結果

Caspase-3陽性表達定位于口腔齦上皮、溝內上皮和結合上皮，主要表達于顆粒細胞層的細胞核內，少量表達于細胞漿中（圖1、2）。實驗組大鼠牙齦上皮內Caspase-3蛋白陽性細胞表達率在頰側和舌側均顯著小于對照組，各實驗組間Caspase-3蛋白陽性細胞表達率在頰側和舌側均無明顯差異（表1）。

圖1 對照組大鼠牙齦上皮內Caspase-3蛋白的表達 PV ×400Fig 1 Expression of Caspase-3 in gingival epithelium of the control group PV ×400

2.3 Bcl-2蛋白表達結果

Bcl-2蛋白陽性表達定位于口腔齦上皮棘細胞層胞漿內和胞核表面，主要集中于附著齦近膜齦聯合處，頰側多于舌側，上皮釘突處密集表達（圖3、4）。實驗組大鼠牙齦上皮內Bcl-2蛋白的平均灰度在頰側顯著大于對照組，在舌側無明顯差異，各實驗組間Bcl-2蛋白的平均灰度在頰側和舌側均無明顯差異（表1）。

圖2 實驗組大鼠牙齦上皮內Caspase-3蛋白的表達 PV ×400Fig 2 Expression of Caspase-3 in gingival epithelium of the experimental group PV ×400

圖3 對照組大鼠牙齦上皮內Bcl-2蛋白的表達 PV ×630Fig 3 Expression of Bcl-2 in gingival epithelium of the control group PV ×630

3 討論

免疫抑制劑、鈣通道阻滯劑和抗癲癇藥物可導致藥物性牙齦增生，其中免疫抑制劑CsP導致牙齦增生的發病率高達30%～50%[1]，嚴重影響牙周組織健康和美觀。但是藥物性牙齦增生的發病機制尚不清楚，近年來，關于CsP導致牙齦上皮增厚的現象逐漸成為關注熱點[2]。

組織增生包括細胞增殖增加和/或細胞凋亡減少，牙齦上皮增厚的發病機理也應如此。Shimizu等[3]以大鼠為實驗對象，研究認為硝苯地平誘導的牙齦上皮增生不是角化細胞增殖增加，而是通過細胞凋亡減少而使細胞周期延長所致，他們特別指出細胞周期延長在肉眼可見的增生發生前就已經發生了。相似的，Niimi等[4]指出服用環孢霉素A的腎移植患者牙齦增生不是由于角化細胞增殖，而是由于細胞壽命延長。近來，Buduneli等[5]測定環孢霉素A誘導的牙齦增生細胞的分裂率和凋亡率，指出凋亡減少可能比細胞分裂增加在環孢霉素A誘導的牙齦增生的發病機制中起著更突出的作用。他們的結果暗示牙齦上皮增生不是由于角化細胞增殖率增加，而是由于角化細胞的壽命增加或是經歷凋亡細胞的能力改變。本課題組假設這也是引起CsP導致牙齦上皮增厚的生物學基礎，故將本實驗聚焦于CsP對大鼠牙齦上皮細胞凋亡通路影響的研究。

細胞凋亡是Kerr等于1972年首次提出的一個形態學概念，是指與細胞壞死不同的受基因控制的有序的細胞死亡形式[6]，其啟動受控于多種因素[7-9]。Bcl-2是膜的整合蛋白，存在于線粒體膜、內質網膜以及核膜上，但主要定位于線粒體膜，其生物學功能為抑制線粒體內促凋亡因子的釋放，在線粒體參與的凋亡途徑中起調控作用，為重要的細胞凋亡抑制蛋白，常被作為細胞凋亡早期和中期的檢測指標[7]。Caspase-3是細胞內的半胱氨酸蛋白酶，是引起細胞凋亡的最終關鍵執行酶，一旦被細胞凋亡的信號途徑激活，能直接降解細胞內的結構蛋白和功能蛋白，使細胞凋亡進入不可逆階段，常被作為細胞凋亡中期和晚期的檢測指標[8]。TUNEL法是運用分子生物學原理結合形態學特征檢測細胞內DNA斷裂后形成的原位凋亡細胞技術，是細胞凋亡晚期的經典檢測方法[9]。

本實驗免疫組織化學染色結果顯示：與對照組相比較，實驗組大鼠牙齦上皮內Bcl-2和Caspase-3蛋白陽性表達范圍和表達密度發生明顯變化，這種變化具有部位特異性，在頰側附著齦近膜齦聯合處Bcl-2蛋白陽性表達明顯增加，Caspase-3蛋白陽性表達明顯減少。實驗組大鼠牙齦上皮釘突少或無的部位，棘細胞層厚度一般無變化，而顆粒細胞層略增厚，此處Bcl-2蛋白陽性表達少或無，Caspase-3蛋白陽性表達分布不均勻，但比對照組略減少。而在牙齦上皮釘突伸長增寬部位，除顆粒細胞層增厚以外，往往伴有棘細胞層明顯增厚現象，這與Wondimu等[10]和Bulut等[11]研究發現相似。此處Bcl-2蛋白陽性表達明顯增多，上方顆粒細胞層中Caspase-3陽性表達明顯減少。

本實驗統計學結果同樣表明：與對照組相比較，實驗組大鼠牙齦上皮內凋亡相關蛋白Bcl-2蛋白的表達上調，Caspase-3蛋白的表達和細胞凋亡指數下調，各組數值在實驗組和對照組間均有顯著差異，且頰側較舌側差異更為明顯，這與本課題組前期實驗結果相同[12]。推測：CsP可以通過抑制牙齦上皮細胞凋亡活動而導致大鼠牙齦上皮增厚，并且抑制凋亡的機制可能存在部位差異。CsP可能通過抑制牙齦上皮釘突處Bcl-2蛋白的表達而抑制線粒體凋亡途徑，從而使該處牙齦上皮增厚，而牙齦上皮其他部位增厚可能由于啟動其他信號而導致Caspase-3蛋白表達發生變化而抑制凋亡。但是CsP對大鼠牙齦上皮部位差異性影響的真正機制尚需深入研究。

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（本文編輯 湯亞玲）

Apoptosis and expression of Bcl-2 and Caspase-3 in Ciclosporin-induced gingival overgrow th of rats

LIU Pei-hong1,MA Su1,CHEN Li2.（1.Dept.of Periodontology,College of Stomatology,Harbin Medical University,Harbin150001,China;2.Dept.of Scientific Research,The First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin150001,China）

ObjectiveTo observe the effect of Ciclosporin（CsP）on apoptosis and expression of the associated protein Bcl-2,Caspase-3 in gingival epithelium of rats in order to approach the mechanism of CsP-induced gingival epithelium overgrowth.MethodsEighty SPF grade male 7-week-old Wistar rats were random ly divided into experimental group and control group,and each group was divided into 4 subgroups according to the duration of treatment（10, 20,30 and 40 days）.The experimental objects were given fresh milk including CsP intragastrically and the control ones were given only fresh milk.After perfusion of 4%paraform for internal fixation,the specimens’bucco-lingual paraffin sections at lower first molar were made.Apoptosis was detected using TdT-mediated dUT nick end labeling（TUNEL）and the expression of Bcl-2 and Caspase-3 using immunohistochemisty of PV.The apoptotic index,positive cell rate of Caspase-3 and average gray scale of Bcl-2 wasmeasured with an image analysis system.Data were analyzed by two-way analysis of variance of factorial design.Results The apoptosis index and positive cell rate of Caspase-3 were downregulated in the experimental group,and were significant difference from the control group（P<0.05）.The average gray scale of Bcl-2 was up-regulated in the experimental group,and was significant difference from the control group（P<0.05）. Conclusion CsP-induced gingival epithelial overgrowth is likely to associated with interference to the path of mitochondrial apoptosis and inhibition apoptosis.

Ciclosporin； drug-induced gingival overgrowth； cell apoptosis

R 781.3

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.023

1000－1182（2011）03－0310-04

2010-10-27；

2011-02-15

黑龍江省衛生廳科研基金資助項目（2006-009）；哈爾濱市科技局優秀學科帶頭人研究專項基金資助項目（2009RFXXS214）

劉培紅（1976—），女，黑龍江人，主治醫師，碩士

馬肅，Tel：0451-85553988