小鼠Dishevelled 2表達質粒的構建及其在RAW 264.7細胞中的表達

黃旭 趙鵑 毛英杰 谷志遠

（1.浙江大學醫學院附屬第一醫院 口腔科，杭州 310003；

2.浙江大學醫學院附屬口腔醫院 修復科；3.頜面外科，杭州 310006）

小鼠Dishevelled 2表達質粒的構建及其在RAW 264.7細胞中的表達

黃旭1趙鵑2毛英杰3谷志遠3

（1.浙江大學醫學院附屬第一醫院 口腔科，杭州 310003；

2.浙江大學醫學院附屬口腔醫院 修復科；3.頜面外科，杭州 310006）

目的 構建小鼠Dishevelled 2（Dvl2）表達質粒，并檢測其轉染小鼠破骨前體細胞RAW264.7后的表達，為進一步研究Dvl2在破骨細胞分化和骨重建中的作用、篩選調節骨重建潛在靶點奠定基礎。方法 根據GenBank小鼠Dvl2 cDNA序列設計兩條特異性引物，提取RAW264.7細胞總RNA，以RT-PCR獲得Dvl2的開放閱讀框（ORF），并將其克隆到真核表達質粒pEZ-M29上，酶切電泳，測序鑒定構建的pEZ-M29/Dvl2質粒。用脂質體介導瞬時轉染RAW 264.7細胞，通過熒光顯微鏡觀察轉染效果，實時定量RT-PCR檢測Dvl2基因表達情況。結果 成功構建pEZ-M29/Dvl2表達載體，酶切電泳和測序結果與目的基因相符；轉染RAW264.7細胞后48 h，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達；實時定量RT-PCR可見實驗組Dvl2基因較對照組強烈過表達。結論 成功構建小鼠Dvl2真核表達質粒pEZ-M29/Dvl2，瞬時轉染小鼠破骨前體細胞RAW264.7可顯著提高Dvl2的mRNA水平。

Dishevelled 2； 表達質粒； RAW264.7細胞； 破骨細胞

骨重建參與口腔醫學的各個方面，如正畸牙的移動、種植體骨整合界面的形成、牙列缺失后牙槽骨的吸收等。研究骨重建的機理，選擇適宜的靶點，一直是口腔醫學研究及臨床的熱點。骨重建中，破骨細胞和成骨細胞不可或缺。破骨細胞功能的過度抑制或破骨細胞缺乏都會影響成骨細胞的骨形成[1-3]。而恢復破骨細胞的功能，則有助于形成正常的骨組織結構[4-5]。破骨細胞和成骨細胞間存在著雙向ephrinB2/EphB4膜分子信號耦聯，當成熟破骨細胞表面的ephrinB2和成骨前體細胞表面的EphB4相接觸時，信號同時、雙向傳入成骨細胞（正向）和破骨細胞（逆向），正向信號激活成骨細胞的分化，而逆向信號抑制破骨細胞的分化[6-7]。這項研究結果很好的解釋了骨重建轉換階段中，破骨細胞骨吸收停止、活性消失，同時成骨細胞分化、活化，這一關鍵現象[6]。這一發現也從信號傳導機制解釋了采用抑制骨吸收的傳統治療方法有時不能促進骨形成的失敗原因，提示了利用破骨細胞促進成骨細胞分化的信號耦聯以治療骨疾病、促進骨整合的新思路以及新靶點，其中，破骨細胞逆向信號傳導下游通路中與ephrinB2作用的結構域蛋白質是潛在的作用靶點[6]。本課題組的最新研究結果，從破骨細胞內表達的多種結構域蛋白質中，篩選出Dishevelled 2（Dvl2）與ephrinB2固有結合，它極可能是參與ephrin-B2/EphB4逆向信號轉導的PDZ結構域蛋白質[8]。但尚需采用實驗證實Dvl2在破骨細胞分化中的功能。

本實驗根據Dvl2編碼區的序列，構建了含CMV啟動子和綠色熒光標記蛋白的表達質粒pEZ-M29/ Dvl2，通過脂質體將其瞬時轉染破骨前體細胞RAW 264.7，通過實時定量PCR的方法鑒定過表達Dvl2的RAW264.7細胞，為深入研究Dvl2在破骨細胞分化中的作用及其在破骨細胞/成骨細胞ephrinB2/EphB4信號耦聯中的作用機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pEZ-M29質粒載體（廣州復能基因有限公司），Taq酶、dNTP、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker、DH5α感受態細胞、PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBRRPremix Ex TaqTMKit（Takara公司，日本）；T4 DNA ligase（Fermentas公司，立陶宛）；SrfⅠ、Eco RⅠ（NEB公司，美國）；250bp DNA ladder plus和鑒定質粒的PCR引物（上海生工生物工程公司）；Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）（碧云天公司）；0.25%Trypsin＆0.02%EDTA（吉諾生物醫藥技術有限公司）；Hyclone磷酸鹽緩沖液（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司）；轉染試劑Lipofectamine 2000、RNA抽提試劑TRIZOL（Invitrogen公司，美國）；質粒提取試劑盒（Axygen公司，美國）；α-MEM培養液和DMEM高糖培養液（Gibco公司，美國）；RAW264.7細胞（ATCC TIB-71）。

1.2 Dvl2基因克隆

按TRIZOL試劑說明書操作提取RAW264.7細胞總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄cDNA。從GenBank查詢鼠Dishevelled 2（NM_007888），dsh homolog（Drosophila）的開放閱讀框（open read length，ORF）序列，并設計帶酶切位點的PCR引物，設計引物如下：F：GAATTCGGTACCATGGCGGG（下劃線標記Eco RⅠ酶切位點）；R：GCCCGGGCTCTTCTACATAA（下劃線標記SrfⅠ酶切位點）。從cDNA中，用RT-PCR反應合成帶酶切位點的Dvl2 ORF片段，PCR產物在1.5%的瓊脂糖膠上100 V，30min檢測條帶。

1.3 酶切

取1μg的pEZ-M29質粒和PCR目的產物，用Eco RⅠ和SrfⅠ37℃雙酶切2 h，1.5%膠電泳，割膠回收大片段的質粒和PCR產物，檢測濃度。

1.4 連接反應

在T4 DNA連接酶作用下，PCR產物和質粒回收片段以10∶1的量進行連接反應，16℃連接1 h。

1.5 轉化

取1支DH5α感受態細胞（每管100μL，-80℃保存）于冰上，待溶解后加入10μL連接液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。將管放到預加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90 s。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2～3min。每管加900μL LB培養液，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育1 h使細菌復蘇。取恰當量的轉化菌液涂布于LB瓊脂平板上。倒置平皿，于恒溫培養箱中37℃培養16 h。

1.6 陽性克隆篩選及鑒定

挑取平板上長出的單菌落，重懸于10μL LB培養液中，從中取1μL做模板進行菌落PCR鑒定。提取質粒，進行酶切和測序鑒定，DNA測序由美國加州浙江大學納米研究院進行。測序引物：Forward：5’-CCGACAACCACTACCTGA-3’，Reverse：5’-GTGGCACCTTCCAGGGTC-3’。測序正確的，再接種抽提質粒。

1.7 脂質體介導pEZ-M29/Dvl2轉染破骨前體細胞RAW264.7

取第3代RAW264.7細胞，進行轉染實驗。轉染前以每孔4.5×105個細胞將RAW264.7細胞接種于6孔板內，置于37℃5%CO2的培養箱中培養，當細胞融合度達90%時，按照Lipofectamine2000的說明書進行過表達載體質粒和空載體質粒的轉染。簡要過程如下：轉染前1～2 h換液，棄掉培養基，加入2mL新鮮完全培養基；將4μg質粒加入到250μL不含血清的opti-MEM培養基中，輕柔混勻制成混合物A備用；將10μL Lipofectamine 2000加入到250μL不含血清的opti-MEM培養基中，輕柔混勻制成混合物B，室溫下放置5min；將A和B輕柔混勻，室溫下靜置20min后，將混合液加入到接種細胞的孔中，輕輕搖勻，置于37℃5%CO2培養箱中培養（未轉染組細胞中加入不含血清的opti-MEM培養基）；4～6 h后換成含雙抗的完全培養基，置于37℃5%CO2培養箱中繼續培養；培養48 h后熒光顯微鏡下拍照，觀察細胞轉染情況。同時收集各組細胞，離心沉淀后用于實時定量RT-PCR。

1.8 實時定量RT-PCR測定Dvl2基因的表達變化

收集各組細胞，以TRIZOL試劑提取RAW264.7細胞總RNA，將提取的總RNA用Rnase free的去離子水溶解，-80℃保存。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄cDNA，操作方法同前。采用SYBRRPremix Ex TaqTMKit試劑盒進行實時定量RT-PCR。PCR反應條件：95℃預變性4min，95℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸60 s，循環40次，然后72℃溫育10min。以Beta-actin作為內參。引物均由Takara公司設計合成。Dishevelled 2 sense：5’-GCAGTGTCACCGATTCCACAA-3’；antisense：5’-CTTTCATGATGGAGCCGATGTAGA-3’；Beta-actin sense：5’-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3’；antisense：5’-TGCCAACACAGTGCTGTCT-3’。獨立重復實驗3次，用2-ΔΔCt方法分析所得數據，以比較各組的基因表達。

2 結果

2.1 重組質粒構建

重組質粒pEZ-M29/Dvl2中Dvl2的ORF長度為2 211 bp，載體長度6 131 bp，經Eco RⅠ和SrfⅠ雙酶切后，凝膠電泳顯示出相應大小的目的基因片段和載體片段；測序結果顯示，重組質粒中目的基因編碼序列結果與GenBank中Dvl2序列一致。

2.2 重組質粒轉染RAW264.7細胞的鑒定

脂質體轉染48h后，熒光顯微鏡下觀察（圖1），可見部分細胞表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），代表轉染成功。

2.3 重組質粒轉染的RAW264.7細胞的Dvl2 mRNA表達

轉染48 h后，即可檢測到重組質粒轉染組較空質粒轉染組Dvl2 mRNA表達水平提高27.5倍（圖2）。

圖1 重組質粒pEZ-M29/Dvl2轉染RAW264.7細胞的形態 熒光顯微鏡 ×40Fig 1 Images of pEZ-M29/Dvl2-transfected RAW 264.7 cells fluorescence microscope ×40

圖2 實時定量RT-PCR測定Dvl2在RAW264.7細胞中的表達Fig 2 Dvl2 mRNA levels of RAW264.7 cells by real-time RTPCR

3 討論

為了進一步研究Dvl2蛋白在破骨細胞分化及功能過程中的作用，本文應用基因工程技術及分子生物學的方法，根據GenBank上公布的小鼠Dvl2 cDNA序列設計2條特異性引物，從小鼠RAW264.7細胞株中提取總RNA，以RT-PCR反應獲得編碼Dvl2蛋白的ORF讀框，并將其克隆到真核表達質粒pEZ-M29上，瞬時轉染RAW264.7細胞，熒光顯微鏡觀察顯示轉染成功，實時定量RT-PCR測定Dvl2基因的表達顯著提高，為建立穩定轉染破骨前體細胞系打下基礎。

本實驗根據Dvl2及載體質粒基因結構特點，構建Dvl2基因真核表達質粒。pEZ-M29質粒是6 131 bp大小的質粒，具有以下幾方面特點：1）自身攜帶能發出綠色熒光的EGFP報告基因，在熒光顯微鏡下，即可觀察到綠色熒光，無需任何作用底物或共作用物，直接、簡捷、便于檢測，檢測的靈敏度高；EGFP綠色熒光蛋白本身性質穩定，可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；EGFP綠色熒光蛋白基因片段長度較小（約717 bp），易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，為研究其他基因表達產物的分布提供了方便。2）含有高效的功能強大的CMV啟動子，可以使目的基因在增殖的細胞中穩定表達。3）具有多克隆位點，便于目的基因的插入。4）該載體具有Ampicillin基因，可以采用氨芐霉素來篩選已成功轉染了該載體的菌株。5）該載體具有Neomycin基因，可以采用G418藥物壓力篩選穩定轉染了該載體的破骨前體細胞，以便用于Dvl2過表達破骨前體細胞的傳代及破骨細胞分化功能研究。

Dvl是一種胞漿蛋白，分為Dvl1、Dvl2和Dvl3，均含有3個保守的蛋白結構域：DIX（Dishevelled-Axin）結構域，PDZ（postsynaptic density protein PSD-95，discslarge，and ZO-1）結構域和DEP（Dsh,Egl10，Pleckstrin）結構域[9]。Dvl2眾所周知的生物學功能是作為Wnt信號通路的關鍵中間傳導分子，參與了上游信號在胞膜、胞漿以及胞核的一系列傳導[10]。Dvl2位于Frizzled/LRP6/G-protein下游、GSK3上游，主要參與3條Wnt信號通路：PDE6-cGMP-Ca2+通路，planar cell polarity/convergent extension（PCP/CE）通路和Wnt/ β-catenin經典通路[9-10]。

Wnt信號通路廣泛參與了各種骨組織活動，包括胚胎骨骼成型、胎兒骨骼發育以及成年骨重建[11-12]。Wnt/β-catenin信號通路可以通過多種機制促進骨形成從而影響骨量，其中，Dvl2作為Wnt信號通路的關鍵分子，在老年人骨中mRNA水平的降低反映出Wnt信號通路的減弱，由此造成骨量的減少；但是在骨關節炎患者中，Dvl2 mRNA表達水平反而升高[13-14]。目前，大多數研究都是針對成骨細胞中Wnt通路及Dvl2對其分化的促進作用以及對破骨細胞分化的間接促進作用，例如，有文獻報道，Wnt對成骨細胞的作用受細胞分化程度的影響，即Wnt可以刺激早期成骨細胞的分化，但是抑制成熟成骨細胞的礦化能力，另外，成骨細胞的分化抑制內源性Wnt信號傳導，并且影響多種Wnt信號通路相關基因的表達[15]。再如，成骨細胞中，甲狀旁腺激素受體（parathyroid hormone receptor，PTHR）通過直接結合Dvl2激活β-catenin及其下游通路（不通過Wnt），直接促進成骨細胞分化，并間接促進破骨細胞分化[16]。但是，鮮有破骨細胞中Dvl2表達及直接參與破骨細胞分化及功能的研究報道。

ephrinB2/EphB4是最新報道的骨重建轉化階段的重要信號耦聯[6-7]，本課題組的最新研究進展提示破骨細胞內Dvl2與ephrinB2固有結合，它極可能是參與ephrinB2/EphB4逆向信號轉導的PDZ結構域蛋白質[8]。生物化學方面的研究表明，Dvl2可以與EphB受體或ephrinB配體固有結合為復合體，受上游分子刺激后，與EphB或ephrinB分離，作為其下游分子傳遞信號[17]。在視網膜前體細胞、神經干細胞等細胞中，ephrinB可經由Dvl2介導的PCP/CE通路及其下游的Rho GTPase通路或c-Jnk通路產生一系列生物活動，特別是細胞骨架蛋白的改變和細胞移動[18]。眾所周知，活化破骨細胞的細胞骨架改變和細胞移動對其功能活動非常重要。但是在破骨細胞中，ephrinB2/EphB4與Dvl2之間的結合是否具有生物學意義，它們的結合是否具有與其在視網膜前體細胞和神經干細胞中相似的功能作用，即是否影響細胞骨架中F-actin蛋白及細胞移動，尚需進一步研究。

[1] Martin TJ,Sims NA.Osteoclast-derived activity in the coupling of bone formation to resorption[J].Trends Mol Med,2005,11（2）：76-81.

[2] Martin TJ.Does bone resorption inhibition affect the anabolic response to parathyroid hormone[J].Trends Endocrinol Metab,2004, 15（2）：49-50.

[3] Khosla S,Westendorf JJ,Oursler MJ.Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures[J].J Clin Invest,2008,118（2）：421-428.

[4] Dai XM,Zong XH,Akhter MP,et al.Osteoclast deficiency results in disorganized matrix,reduced mineralization,and abnormal osteoblast behavior in developing bone[J].J Bone Miner Res,2004, 19（9）：1441-1451.

[5] Sakagami N,Amizuka N,Li M,et al.Reduced osteoblastic population and defective mineralization in osteopetrotic（op/op）mice[J]. Micron,2005,36（7/8）：688-695.

[6] Mundy GR,Elefteriou F.Boning up on ephrin signaling[J].Cell, 2006,126（3）：441-443.

[7] Zhao C,Irie N,Takada Y,et al.Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis[J].Cell Metab,2006,4（2）：111-121.

[8] Mao Y,Huang X,Zhao J,et al.Preliminary identification of potential PDZ-domain proteins downstream of ephrin B2 during osteoclast differentiation of RAW264.7 cells[J].Int J Mol Med,2011, 27（5）：669-677.

[9] Malbon CC,Wang HY.Dishevelled：A mobile scaffold catalyzing development[J].Curr Top Dev Biol,2006,72：153-166.

[10]Yokoyama N,Malbon CC.Dishevelled-2 docks and activates Src in a Wnt-dependent manner[J].J Cell Sci,2009,122（Pt 24）：4439-4451.

[11] Hartmann C.AWnt canon orchestrating osteoblastogenesis[J].Trends Cell Biol,2006,16（3）：151-158.

[12]Krishnan V,Bryant HU,Macdougald OA.Regulation of bone mass by Wnt signaling[J].J Clin Invest,2006,116（5）：1202-1209.

[13] Sánchez-SabatéE,Alvarez L,Gil-Garay E,et al.Identification of differentially expressed genes in trabecular bone from the iliac crest of osteoarthritic patients[J].Osteoarthritis Cartilage,2009,17（8）：1106-1114.

[14] Velasco J,Zarrabeitia MT,Prieto JR,et al.Wnt pathway genes in osteoporosis and osteoarthritis：Differential expression and genetic association study[J].Osteoporos Int,2010,21（1）：109-118.

[15] Eijken M,Meijer IM,Westbroek I,et al.Wnt signaling acts and is regulated in a human osteoblast differentiation dependentmanner[J].J Cell Biochem,2008,104（2）：568-579.

[16] Romero G,Sneddon WB,Yang Y,et al.Parathyroid hormone receptor directly interacts with dishevelled to regulate beta-Catenin signaling and osteoclastogenesis[J].J Biol Chem,2010,285（19）：14756-14763.

[17] Lee HS,Mood K,Battu G,et al.Fibroblast growth factor receptorinduced phosphorylation of ephrinB1 modulates its interaction with Dishevelled[J].Mol Biol Cell,2009,20（1）：124-133.

[18] Rohn JL,Baum B.Actin and cellular architecture at a glance[J]. J Cell Sci,2010,123（Pt 2）：155-158.

（本文編輯 湯亞玲）

Construction of vectors encoding mouse Dishevelled 2 and its expression in RAW 264.7 cells

HUANG Xu1,ZHAO Juan2,MAO Ying-jie3,GU Zhi-yuan3.（1.Dept.of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310003,China;2.Dept.of Prosthodontics,The Affiliated Hospital of Stomatology,Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310006,China;3.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The Affiliated Hospital of Stomatology,Medical College of Zhejiang University,Hangzhou310006,China）

ObjectiveTo construct the recombinant vectors that express mouse Dishevelled 2（Dvl2）,and to evaluate its expression level in transfected RAW264.7 cells.MethodsA pair of specific primers were designed according to the mouse Dvl2 cDNA sequence published in GenBank.Total RNA of RAW264.7 cells was extracted,and open reading frame of Dvl2 was obtained by RT-PCR,which was then cloned into pEZ-M29 plasmid.Electrophoresis after macrorestriction and DNA sequence analysis were used to identify the reconstructed plasmids.After transient transfection via liposome,the transfection of RAW264.7 cells was confirmed under a fluorescence microscope,and the expression level of Dvl2 was evaluated by real-time RT-PCR.Results The recombinant plasmid containing mouse Dvl2,namely pEZ-M29/ Dvl2,was successfully constructed,and confirmed by DNA sequence analysis.After 48 h of tranfection,the expression of enhanced green fluorescene protein was observed under a fluorescence microscope,and real-time RT-PCR analysis revealed that the Dvl2 mRNA level was prominantly elevated in the transient transfected RAW264.7 cells.ConclusionThe recombinant plasmids pEZ-M29/Dvl2 are successfully constructed and can elevate the Dvl2 mRNA level in the transient transfected RAW264.7 cells,which can be used in further studies aiming at revealing the functional significance of Dvl2 in the osteoclastogenesis.

Dishevelled 2； expression plasmid； RAW264.7 cells； osteoclasts

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.022

1000－1182（2011）03－0306-04

2010-12-17；

2011-03-10

國家自然科學基金資助項目（30700958）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2100333）

黃旭（1977—），男，浙江人，主治醫師，碩士

趙鵑，Tel：0571-87217225