口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的拮抗作用

張琳 孫珺 李多 肖曉蓉 朱硃 龔其美 周紅梅

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學；2.四川大學華西口腔醫院 黏膜科，成都 610041）

口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的拮抗作用

張琳1孫珺1李多1肖曉蓉1朱硃1龔其美1周紅梅2

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學；2.四川大學華西口腔醫院 黏膜科，成都 610041）

目的 觀測3種口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的生長有無抑制作用。方法 采用直接點種法、反點種菌落計數法和液體共培養法觀測口腔變異鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌對白假絲酵母菌的拮抗作用。結果 1）直接點種法中各組均未觀察到清晰的抑菌圈；2）唾液鏈球菌軟瓊脂上的白假絲酵母菌菌落數較對照組減少（P＜0.05）；3）活菌與白假絲酵母菌液體共培養中，在各個時間點上變異鏈球菌組與對照組之間菌落計數差異均有統計學意義（P=0.001）；4）細菌培養基上清液與白假絲酵母菌液體共培養中，在24、48、72h時間點上，各實驗組與對照組之間菌落計數差異均有統計學意義（P=0.001）；多數時間點上，各實驗組間菌落計數差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 3種口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的體外生長有明顯抑制作用，但尚不能確定哪種鏈球菌的抑制作用更強，并且抑制作用會逐漸衰減。

白假絲酵母菌； 變異鏈球菌； 唾液鏈球菌； 血鏈球菌； 拮抗作用

近年來，有關各型口腔鏈球菌對白假絲酵母菌拮抗作用的研究較多，但主要集中在營養競爭、黏附競爭等方面。學者[1]從血鏈球菌分離出小分子抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）拮抗變異鏈球菌，本課題組前期研究發現口腔放線菌可能分泌某種拮抗物質對白假絲酵母菌產生抑制作用[2]。上述實驗結果均提示：口腔鏈球菌是否也可能通過產生一些抗真菌物質來拮抗白假絲酵母菌呢？本研究擬觀測3種口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的拮抗作用，為研究口腔黏膜微生態中的菌群間相互作用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌株及試劑

口腔白假絲酵母菌標準株ATCC10691、口腔變異鏈球菌標準株ACTT25175、口腔血鏈球菌標準株ACTT10556、口腔唾液鏈球菌標準株ACTT93419由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。1.6%TPY軟瓊脂、TPY液體培養基、CHROMagar假絲酵母菌選擇培養基（鄭州博賽生物制品公司）。

1.2 實驗方法

采用直接點種法、反點種菌落計數法、活菌與白假絲酵母菌液體共培養法、細菌培養基上清液與白假絲酵母菌液體共培養、滅活細菌與白假絲酵母菌液體共培養法觀測3種口腔鏈球菌對白假絲酵母菌的拮抗作用。

1.2.1 直接點種法[3-4]配制含有白假絲酵母菌菌懸液（1×108、1×107CFU·mL-1）的TPY軟瓊脂（1∶10）和3種鏈球菌懸液（1×108、1×107、1×106CFU·mL-1）。于白假絲酵母菌TPY軟瓊脂上分別點種不同濃度的3種鏈球菌各5μL，同時點種相同劑量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為對照組。于兼性厭氧環境下培養24 h，觀察是否出現抑菌圈。

1.2.2 反點種菌落計數法[2]配制含有唾液鏈球菌、血鏈球菌和變異鏈球菌菌懸液（1×108CFU·mL-1）的TPY軟瓊脂（1∶10），以不含菌懸液的TPY軟瓊脂作為對照組。配制白假絲酵母菌菌懸液，用PBS連續稀釋至1×103CFU·mL-1。各平板分別點種6個點，每點點種5μL白假絲酵母菌菌懸液。于兼性厭氧環境下培養24 h，觀察每點5μL白假絲酵母菌菌落數的變化。

1.2.3 活菌與白假絲酵母菌液體共培養法 配制白假絲酵母菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌和變異鏈球菌菌懸液（1×108CFU·mL-1）。將白假絲酵母菌分別和3種鏈球菌菌懸液各100μL共培養于2mL TPY液體培養基中，共培養5組用于連續觀察。將白假絲酵母菌菌懸液100μL培養于1mL TPY液體培養基中，共培養5組作為對照組。于兼性厭氧環境下培養120 h，每24h取出一組連續稀釋至1×103CFU·mL-1后，各取20μL點種于CHROMagar選擇培養基上，24 h后菌落計數。每組重復3次。

1.2.4 細菌培養基上清液與白假絲酵母菌液體共培養 配制3種鏈球菌菌懸液（1×108CFU·mL-1）。分別取1mL上述液體與9mL TPY液體培養基混勻，培養24 h后，各取2mL液體培養基，于2 000 r·min-1離心5min后，分離提取上清液1mL與1mL白假絲酵母菌菌懸液（2.4×108CFU·mL-1）共培養于8mL TPY液體培養基中。對照組用PBS溶液1mL與白假絲酵母菌菌懸液1mL置于8mL TPY液體培養基中。連續培養120 h，每24h取出1mL菌懸液倍比稀釋至1×103CFU·mL-1，各取20μL點種于CHROMagar選擇培養基上，培養24 h后進行菌落計數，并換算成對數值。每組重復3次。

1.2.5 滅活細菌與白假絲酵母菌液體共培養法[2]在瓊脂糖平板上分別接種3種鏈球菌，37℃培養24 h后，將平板置于紫外燈下0.5m處照射2 h。為了驗證紫外線是否將細菌滅活，照射后取菌轉種至另一瓊脂糖平板，37℃培養24 h后觀察是否能長出菌落。結果3個轉種平板上均未出現鏈球菌菌落[3]。實驗組設置為3組，每組取足夠的滅活菌配制菌懸液（調整密度為1×108CFU·mL-1），取1mL菌懸液與1mL白假絲酵母菌菌懸液置于8mL液體培養基共培養120 h，對照組用1mL PBS溶液與1mL白假絲酵母菌菌懸液置于8mL TPY液體培養基中。連續培養120h，每24 h取出1mL菌懸液倍比稀釋至1×103CFU·mL-1后，取20μL點種于CHROMagar選擇培養基上，培養24 h后進行菌落計數，并換算成對數值。每組重復3次。

1.3 統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，反點種菌落計數法組間均數比較用單因素方差分析，余實驗結果均采用重復測量方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 直接點種法

各組均未觀察到清晰的抑菌圈，除對照組外，各組與白假絲酵母菌草坪菌交界處可見1mm左右透亮區域。

2.2 反點種菌落計數法

唾液鏈球菌軟瓊脂上的白假絲酵母菌菌落數較對照組減少（P<0.05），變異鏈球菌、血鏈球菌軟瓊脂上的白假絲酵母菌菌落數大于100而無法確切計數（表1）。唾液鏈球菌的抑菌作用與直接點種法結果一致。

表1 3種鏈球菌軟瓊脂點種白假絲酵母菌24 h后菌落計數Tab 1 Counted of Saccharomyces albicans on three kinds of TPY soft agar after 24 h CFU·m L-1

2.3 活菌與白假絲酵母菌液體共培養法

根據各個時間點菌落數的對數值表（取平均值）繪制的白假絲酵母菌生長變化曲線見圖1。統計分析表明：在各個時間點上變異鏈球菌組與對照組之間菌落計數差異均有統計學意義（P=0.001），唾液鏈球菌組以及血鏈球菌組在72、96、120 h時間點上，與對照組相比其差異具有統計學意義（P=0.001）。3個實驗組白假絲酵母菌菌落數目在24、48、72 h均低于正常對照組，說明3種細菌可抑制白假絲酵母菌的生長。

圖1 鏈球菌活菌與白假絲酵母菌液體共培養中白假絲酵母菌的生長變化曲線Fig 1 Growth curve of Saccharomyces albicans in mixed culture with bacteria

2.4 細菌培養基上清液與白假絲酵母菌液體共培養

根據各個時間點菌落數的對數值表（取平均值）繪制的白假絲酵母菌生長變化曲線見圖2。統計分析表明：在24、48、72 h時間點上，各實驗組與對照組之間菌落計數差異均有統計學意義（P=0.001）；多數時間點上，各實驗組間菌落計數差異無統計學意義（P＞0.05）。總體來講，3種鏈球菌上清液對白假絲酵母菌的生長具有抑制作用，但隨著時間的推移，這種抑制作用呈現衰減趨勢。與活菌與白假絲酵母菌液體共培養法的結果做橫向比較，二者結果基本一致，說明3種鏈球菌可分泌某種物質從而產生對白假絲酵母菌的拮抗作用。

圖2 細菌培養基上清液與白假絲酵母菌液體共培養中白假絲酵母菌的生長變化曲線Fig 2 Growth curve of Saccharomyces albicans in mixed culture with supernate of bacteria culture media

2.5 滅活細菌與白假絲酵母菌液體共培養法

根據各個時間點菌落數的對數值表（取平均值）繪制的白假絲酵母菌生長變化曲線見圖3。從圖3可見，各組細菌總量呈下降趨勢，但對照組與實驗組之間數據波動大，曲線呈交織狀，尚不能肯定3種口腔鏈球菌在此種處理下對白假絲酵母菌仍有抑制作用。

圖3 滅活的細菌與白假絲酵母菌液體共培養中白假絲酵母菌的生長變化曲線Fig 3 Growth curve of Saccharomyces albicans in mixed culture with killed bacteria

3 討論

白假絲酵母菌是一種常見的人類共棲菌，常見于口腔、消化道黏膜。白假絲酵母菌是一種條件致病菌，當機體發生菌群失調或抵抗力下降時可引起白假絲酵母菌病，為該類感染的主要菌群[5]。傳統觀點認為白假絲酵母菌病的發病機制是一些可產生抗菌物質的口腔正常菌群被抑制，從而導致白假絲酵母菌過度繁殖[6]。早期研究[7]認為：細菌與白假絲酵母菌呈拮抗關系是通過爭奪營養物、生長因子等生長繁殖所需的物質。Vílchez等[8]研究表明變異鏈球菌可通過分泌脂肪酸信號分子改變白假絲酵母菌的形態轉變。近年來的研究熱點是細菌通過競爭黏膜上皮細胞的表面受體，影響白假絲酵母菌的定植[9]。

其他可能的拮抗機制如某些口腔細菌是否產生抗念珠菌物質或一些代謝產物來改變白假絲酵母菌生長環境等，目前少見報道。本課題組前期研究發現口腔常駐放線菌在體外均可抑制白假絲酵母菌的生長繁殖，即對后者產生拮抗作用。放線菌的上清液對白假絲酵母菌的生長有明顯抑制作用[2]。在本研究中，選取了3種常見口腔鏈球菌（唾液鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌）來觀察其在體外與白假絲酵母菌的關系。研究結果初步證實：唾液鏈球菌、變異鏈球菌和血鏈球菌在體外均可抑制白假絲酵母菌的生長繁殖，即對后者產生拮抗作用。在直接點種法中，各組均有明顯的抑菌圈，提示這些細菌可能分泌某種抗菌物質。而在反點種菌落計數法中，由于變異鏈球菌和血鏈球菌數目過多，難以觀察到明顯的抑菌圈。為進一步了解拮抗作用機制，本研究將上述3種細菌與白假絲酵母菌共同置于液體培養基中，解決了平板培養基中可能存在營養不足的問題。3種鏈球菌和上清液分別與白假絲酵母菌共培養的實驗結果說明：無論是活菌體還是其分泌的上清液對白假絲酵母菌均有明顯的抑制作用。但是，尚不能肯定何種細菌作用更強。根據各實驗組白假絲酵母菌菌落數生長變化曲線，在72或96 h后，這種抑制作用呈現衰減趨勢。推測這種抑制作用的衰減與細菌的生長繁殖周期以及物理化學環境的改變有關。最后，為明確此種拮抗作用是否還有可能來源于細菌組成成分，將3種無分泌功能的滅活菌體和白假絲酵母菌進行共同培養，但該法所得數據不穩定，波動性較大。

目前有不少關于鏈球菌抗菌物質的報道，如變異鏈球菌可通過代謝產生脂肪酸改變環境pH值，從而抑制其他細菌生長；血鏈球菌通過產生較高濃度的H202殺滅細菌[10]，同時可分泌血鏈素拮抗牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌等[11-12]；變異鏈球菌分泌變鏈素能殺滅血鏈球菌和黏性放線菌[13]等。今后的研究應進一步了解鏈球菌和白假絲酵母菌相互作用的機制，借助生物學手段科學地篩選出有效的拮抗物質并運用于白假絲酵母菌感染的臨床治療上。口腔細菌種類繁多，細菌之間相互作用的研究還有待深入，這將對重建口腔有益菌群的優勢狀態、口腔黏膜疾病的預防和治療具有很大幫助。

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（本文編輯 李彩）

The antagonistic effect of the oral Streptococcus on the Saccharomyces albicans in vitro

ZHANG Lin1,SUN Jun1,LI Duo1,XIAO Xiao-rong1,ZHU Zhu1,GONG Qi-mei1,ZHOU Hong-mei2.（1.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China;2.Dept.of Oral Medicine,West China School of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo investigate the antagonistic effects of three species of oral Streptococcus on the growth of oralSaccharomyces albicans in vitro.MethodsDirect inoculation method,reverse inoculation method and mixed culture methods were respectively chosen to observe the changes ofSaccharomyces albicanscolony formation on the effects ofStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandStreptococcus salivarius.Results 1）No clear inhibition zone was observed in each of the groups by direct inoculation method.2）Compared with the control groups,Saccharomyces albicanscolony formation on soft agar ofStreptococcus sanguisdecreased significantly（P＜0.05）.3）Mixed culture method results showed thatStreptococcus mutanscould inhibit the growth ofSaccharomyces albicanssignificantly at different time points（P=0.001）.4）Under the action of bacteria culture supernatant,the count ofSaccharomyces albicansin experiment groups showed statistical significance when compared with the control groups at 24,48,72 h（P=0.001）;The differences among the experimental groups were of no statistical significance at majority times（P＞0.05）.ConclusionStreptococcus mutans,Streptococcus sanguis,andStreptococcus salivariuscould obviously inhibit the growth ofSaccharomyces albicans in vitro.However,it is still unclear that among which the inhibition effects is stronger.The antagonistic effects is weakened gradually.

Saccharomyces albicans；Streptococcus mutans；Streptococcus sanguis；Streptococcus salivarius；antagonistic effect

R 780.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.021

1000－1182（2011）03－0302-04

2010-10-13；

2010-12-10

高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20070610-067）

張琳（1986—），女，河北人，碩士

周紅梅，Tel：028-85503480