正畸牙根吸收與齦溝液中牙本質涎磷蛋白和牙本質涎蛋白相關性的實驗研究

左志剛 胡敏 姜歡 田莉

（1.吉林大學口腔醫院 正畸科；2.吉林大學 分子酶學工程教育部重點實驗室，長春 130021）

正畸牙根吸收與齦溝液中牙本質涎磷蛋白和牙本質涎蛋白相關性的實驗研究

左志剛1胡敏1姜歡1田莉2

（1.吉林大學口腔醫院 正畸科；2.吉林大學 分子酶學工程教育部重點實驗室，長春 130021）

目的 探討大鼠齦溝液中牙本質涎磷蛋白（DSPP）和牙本質涎蛋白（DSP）的表達與實驗性牙移動所致牙根吸收的關系。方法 36只健康Wistar大鼠隨機分成3組：對照組、輕力組、重力組。以上頜切牙為支抗，輕力組和重力組分別以0.392、0.98N力拉右側上頜第一磨牙向近中移動。加力7 d后，提取齦溝液，制備實驗牙及其牙周組織切片，行蘇木精-伊紅染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察牙根吸收情況，并通過Western blot檢測齦溝液中DSPP、DSP的表達。結果 組織學觀察：對照組未見明顯的牙根吸收，輕力組未見明顯的牙根吸收及破牙骨質細胞，重力組在根尖1/3遠中區及根分叉附近出現明顯牙根吸收。Western blot結果顯示：對照組中只有DSPP表達，輕力組和重力組中有DSPP和DSP表達。3組大鼠齦溝液中DSPP、DSP蛋白的表達均有統計學差異（P<0.05），重力組中2種蛋白表達最高，輕力組次之，對照組最低。結論 在正畸所導致的牙根吸收過程中，齦溝液中有DSPP和DSP的表達。

牙根吸收； 齦溝液； 牙本質涎磷蛋白； 牙本質涎蛋白

牙根吸收是正畸牙移動過程中不易避免的一種現象，目前對于牙根吸收的檢查、診斷手段有限[1]，臨床上主要應用X線片，但其具有滯后性、靜態性等不可避免的局限性，而且確立診斷后也沒有行之有效的治療措施。因此，早期診斷、監測牙根吸收的發生、發展，對于正畸導致的牙根吸收的基礎研究和正畸臨床工作都有很大的意義。牙本質涎磷蛋白（dentin sialoph-osphoprotein，DSPP）和牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）屬于牙本質特異性蛋白，在人的一生中牙本質不斷地沉積，這些蛋白通常不被釋放到周圍組織中，而在牙根吸收活動期牙本質重塑的時候，這些蛋白會釋放到牙周膜間隙。近年，齦溝液分析技術得到了迅速的發展，由于其具有方便、無創、準確等優點，目前在牙周臨床檢查中廣泛應用。本實驗以大鼠為研究對象，建立實驗性牙移動致牙根吸收模型，通過Western blot等手段研究大鼠齦溝液中DSPP/DSP的表達，為利用分子生物學方法早期診斷、監測牙根吸收提供新的思路和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠36只（吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供），體重0.25 kg±0.02 kg，普通飼料分籠飼養，自由攝食飲水。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 牙移動致牙根吸收模型的建立

將36只Wistar大鼠隨機分成3組：對照組、輕力組和重力組，每組12只。在輕力組和重力組動物的右側上頜切牙和第一磨牙間置NiTi螺簧，以左右上頜切牙為支抗，分別以0.392 N、0.98 N力拉右側上頜第一磨牙向近中移動。對照組動物予以偽實驗。每日檢查裝置是否脫落或損壞。隔天測定力值，隨時調整NiTi螺簧，以保持力值恒定（圖1）。

圖1 大鼠牙齒移動模型Fig 1 The model of tooth movement of rat

1.3 齦溝液提取及處理

加力7 d后，提取各組動物齦溝液并進行樣本處理。將大鼠麻醉后固定，干燥右側上頜磨牙及周圍牙齦黏膜，鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側牙齦邊緣，使游離齦與牙面輕微分開，將預先剪掉尖端0.5mm并已高溫高壓消毒的15號吸潮紙尖（北京達雅鼎醫療器械有限公司）輕輕插入右側上頜第一磨牙近、遠中腭側齦溝內至有輕微阻力即停止（約1.0mm深），留置30 s后取出，間隔1min后重復2次，帶血樣本棄去，將紙尖密封于已消毒好的微型離心管中。加入1%的磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）120μL，常溫下洗脫1 h，15 000 r·min-1離心5min使蛋白溶解于緩沖液中，棄去吸潮紙尖，提取100μL上清液。-70℃保存上清液。

1.4 組織標本的制備

所有動物于提取齦溝液后，應用4%多聚甲醛經心臟灌注處死。切取上頜骨組織（實驗側上頜磨牙區及其周圍牙槽骨組織），將標本固定于4%多聚甲醛液中48 h后，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）常溫脫鈣6周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規石蠟包埋。將標本沿磨牙長軸進行近遠中向連續切片，每張厚約5μm。選取可見到上頜第一磨牙近中牙根根管的組織切片行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色以觀察移動牙周圍牙槽骨及牙根吸收的情況。

1.5 齦溝液樣本的Western blot分析

4℃下，利用Bradford方法確定各齦溝液樣本中的蛋白含量，保證上樣時總蛋白量相等。然后制備凝膠，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后進行蛋白印跡（Western blot分析）。利用BandScan 5.0圖像分析軟件測定各組樣本中DSPP、DSP的灰度值，并對其蛋白條帶的灰度進行掃描分析。

1.6 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件對數據進行多組樣本均數的LSD檢驗，分別比較3組樣本中DSPP、DSP兩種蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 大體標本觀察

對照組：實驗牙無明顯變化，第一磨牙和第二磨牙間無間隙。輕力組：實驗牙明顯近中移動，第一磨牙和第二磨牙間間隙平均約1.5mm。重力組：實驗牙近中移動少許，第一磨牙和第二磨牙間無間隙或有少量間隙（不足0.5mm）。

2.2 組織學結果

3組標本的組織學觀察結果見圖2和3。對照組：未見明顯的牙根吸收和骨吸收。輕力組：未見明顯的牙根吸收及破牙骨質細胞，但骨吸收明顯，且多為直接骨吸收，在牙槽骨骨吸收陷窩內可見多核破骨細胞，TRAP染色陽性。重力組：根尖1/3遠中區及根分叉附近出現明顯牙根吸收現象，牙骨質大面積嚴重吸收，絕大多數累及牙本質，吸收區可見多核破牙本質細胞，根吸收區附近的牙槽骨多數可見破骨活動，牙槽骨內可見潛掘性骨吸收，TRAP染色在牙根吸收和骨質吸收處可見陽性細胞。

圖3 輕力組標本的組織學觀察結果 TRAP ×400Fig 3 Results of histological observation of light force group TRAP ×400

2.3 Western blot分析結果

Western blot分析結果見圖4，從圖4可見，對照組中有1條目的蛋白帶，輕力組和重力組各有2條目的蛋白帶。根據分子量判斷，對照組中的目的蛋白帶為DSPP，輕力組和重力組中的2條目的蛋白帶為DSPP和DSP。

圖4 Western blot分析結果Fig 4 The results of Western blot analysis

3組齦溝液樣本中DSPP、DSP的條帶灰度值比較見圖5。統計分析表明：3組大鼠齦溝液中DSPP、DSP蛋白的表達均有統計學差異（P<0.05），重力組中2種蛋白表達最高，輕力組次之，對照組最低。

圖5 3組齦溝液樣本中DSPP、DSP的條帶灰度值比較Fig 5 The gray value of DSPP,DSP among the gingival crevicular fluid of three groups

3 討論

3.1 牙本質磷蛋白、牙本質涎蛋白在牙本質形成過程中的作用

牙本質涎磷蛋白和/或由其編碼的兩種蛋白質——牙本質磷蛋白和牙本質涎蛋白參與前期牙本質礦化為牙本質的過程，在成牙本質細胞分化、牙本質基質形成、礦化及穩定性維持等方面均起到非常重要的作用[2-5]，并且還具有誘導修復性牙本質生成的功能[6-7]。

Nakashima等[8]的研究表明：DSP在牙髓損傷后第三期牙本質的形成過程中表達增強，提示當成牙本質細胞受到破壞時，未分化的間充質細胞分泌基質、基質蛋白及生長因子，促進牙髓的自身修復，DSP在這一過程中發揮重要作用。張蓉等[9]對DSPP在牙髓異常狀態下的表達情況進行了研究，結果也提示DSPP可能在牙髓損傷后的早期自身修復中起作用。

在正畸治療導致牙根吸收時，牙齒同樣會發生自身防御性反應而形成修復性牙本質，在這種牙根吸收造成牙齒損傷后牙齒的自身修復過程中，DSPP、DSP是否發揮作用以及其表達情況究竟如何呢？本研究以大鼠為研究對象，建立齦溝液提取方法和牙移動致牙根吸收模型，通過Western blot手段比較各組動物齦溝液樣本中DSPP、DSP的表達，進一步探討牙本質磷蛋白、牙本質涎蛋白在牙本質形成過程中的作用。

3.2 動物模型參數的建立

目前研究[10-14]中采用NiTi拉簧拉第一磨牙向近中傾斜移動的參考力值有0.294、0.392、0.490、0.588、0.833 N不等。King等[10]采用NiTi拉簧，以上頜雙側切牙為支抗拉第一磨牙向近中傾斜移動，結果發現：0.294～0.588N力是較適合的正畸力，此時大鼠磨牙發生明顯近中移動而未出現牙根吸收。學者[15-17]研究表明：對大鼠磨牙使用0.784 N或0.980 N正畸力時，牙周組織中破骨細胞的數量減少，牙周組織透明性變區范圍大而廣，牙齒移動速度慢于輕力組，并可見潛掘性骨吸收和不同程度的牙根吸收，在加力3 d時即出現牙根吸收，加力7 d時牙根吸收達到峰值；而0.392N或0.490N力值組的細胞反應較為活躍，整個加力周期內（14 d）牙周組織破壞較小，透明性變區范圍小，主要引起直接性骨吸收。由于本實驗旨在探尋大鼠齦溝液中DSPP和DSP的表達是否與牙移動所致牙根吸收有關，故本實驗輕力組選用0.392N力，重力組選用0.980N力，并選擇加力7 d時處死動物觀察實驗結果。

3.3 實驗結果分析

本實驗結果顯示：對照組齦溝液樣本中有DSPP表達，無DSP表達，提示在正常狀態下，牙本質細胞外基質蛋白可能以DSPP的形式存在，并且釋放到齦溝液中。DSPP的功能可能與繼發性牙本質一直持續不斷地形成有關，其在牙本質形成、礦化過程中起一定作用[18]。輕力組牙移動齦溝液樣本中DSPP、DSP均有表達，且表達量高于對照組。提示在矯治施力過程中，力對牙體組織的刺激會引起牙齒的防御和/或反應性變化，從而引起成牙本質細胞分泌DSPP的量明顯增多，DSPP在發揮作用過程中裂解，作為裂解片段之一的DSP亦釋放到牙周組織中，在齦溝液中有所表達。重力組牙移動齦溝液樣本中同時有DSPP、DSP的表達，且表達量高于其他兩組。這一結果與Balducci等[19]的研究結果相一致。這提示，在重力牙移動引起牙齒牙骨質大面積吸收甚至侵及牙本質時，牙齒發生自身防御性反應形成修復性牙本質，在這一過程中，部分成牙本質細胞受到刺激發生變性，牙髓深層的未分化間充質細胞分化為成牙本質細胞，分泌牙本質細胞外基質并礦化形成修復性牙本質[20]。此時細胞外基質蛋白中DSPP的表達量明顯增多，并且裂解反應增加，故DSP在齦溝液中的表達顯著增加。即在牙根吸收等牙齒損傷的發展過程中，隨著損傷程度的增加，齦溝液中DSPP、DSP濃度隨之增加，且這些蛋白表達增強的時間點可能發生在臨床上或組織學上探測到牙齒損傷之前。

3.4 臨床意義與展望

目前臨床工作中，牙根吸收的診斷、檢測主要依賴X線檢查，然而X線只有在礦化組織喪失60%～70%時才能發現牙根吸收，即在治療5～6個月后牙根吸收才可以有可靠的X線診斷[1]，具有一定的滯后性。所以，尋找一種新的評估方法早期診斷、監測牙根吸收，對于正畸臨床工作有很大的意義。

本實驗3組樣本中DSPP和DSP的表達差異有統計學意義，其中重力組2種蛋白表達最高，輕力組次之，對照組最低，提示齦溝液中DSPP和/或DSP參與了正畸所導致的牙根吸收的過程，同時提示DSPP和/或DSP可能作為一種生物學指標，用于牙根吸收有X線表現或者臨床表現之前對牙根吸收進行早期診斷和檢測，從而提醒臨床醫生采取適當措施預防或阻斷牙根吸收的發生、發展。當然，今后尚需進一步實驗來探討DSPP、DSP在牙根吸收發生、發展過程中的作用機制，并通過時間軸上的縱向研究尋找2種蛋白在齦溝液中濃度表達的變化規律，進而得到預示牙根吸收發生的準確濃度，從而進一步指導相關臨床實驗的進行。

[1] Levander E,Bajka R,Malmgren O.Early radiographic diagnosis of apical root resorption during orthodontic treatment：A study of maxillary incisors[J].Eur J Orthod,1998,20（1）：57-63.

[2] Baba O,Qin C,Brunn JC,et al.Colocalization of dentin matrix protein 1 and dentin sialoprotein at late stages of ratmolar development[J].Matrix Biol,2004,23（6）：371-379.

[3] Hao J,Zou B,Narayanan K,et al.Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation [J].Bone,2004,34（6）：921-932.

[4] MacDougall M.Dental structural diseasesmapping to human chromosome 4q21[J].Connect Tissue Res,2003,44（Suppl 1）：285-291.

[5] Kim JW,Hu JC,Lee JI,et al.Mutational hot spot in the DSPP gene causing dentinogenesis imperfecta typeⅡ[J].Hum Genet, 2005,116（3）：186-191.

[6] Smith AJ,Tobias RS,Cassidy N,et al.Odontoblast stimulation in ferrets by dentine matrix components[J].Arch Oral Biol,1994, 39（1）：13-22.

[7] Tziafas D,Alvanou A,Panagiotakopoulos N,et al.Induction of odontoblast-like cell differentiation in dog dental pulps after in vivo implantation of dentine matrix components[J].Arch Oral Biol, 1995,40（10）：883-893.

[8] Nakashima M,Mizunuma K,Murakami T,et al.Induction of dental pulp stem cell differentiation into odontoblasts by electroporation-mediated gene delivery of growth/differentiation factor 11（Gdf11）[J].Gene Ther,2002,9（12）：814-818.

[9] 張蓉,肖明振,趙守亮,等.早期牙髓損傷修復中牙本質涎磷蛋白表達的免疫組化研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2001,11（2）：89-91.

ZHANG Rong,XIAO Ming-zhen,ZHAO Shou-liang,et al.Immunohistochemical study on expression of dentin sialophosphoprotein during early pulp injury and reparation[J].Chin J Conserv Dent, 2001,11（2）：89-91.

[10] King GJ,Keeling SD,McCoy EA,et al.Measuring dental drift and orthodontic tooth movement in response to various initial forces in adult rats[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop,1991,99（5）：456-465.

[11] Gu G,Lemery SA,King GJ.Effect of appliance reactivation after decay of initial activation on osteoclasts,tooth movement,and root resorption[J].Angle Orthod,1999,69（6）：515-522.

[12] Shirazi M,Nilforoushan D,Alghasi H,et al.The role of nitric oxide in orthodontic tooth movement in rats[J].Angle Orthod,2002, 72（3）：211-215.

[13] Rana MW,Pothisiri V,Killiany DM,et al.Detection of apoptosis during orthodontic tooth movement in rats[J].Am JOrthod Dentofacial Orthop,2001,119（5）：516-521.

[14] 楊美祥,丁寅,徐如生,等.正畸牙齒移動中IL-1β在骨質疏松大鼠牙周組織中的分布變化[J].華西口腔醫學雜志,2000,18（5）：314-316.

YANG Mei-xiang,DING Yin,XU Ru-sheng,et al.Distribution of IL-1βin periodontium of experimental osteoporosis rats during orthodontic tooth movement[J].West China J Stomatol,2000,18（5）：314-316.

[15] 盧燕勤,張素銀,任力鋒,等.正畸大鼠磨牙牙周膜內破骨細胞的出現與應力的關系[J].口腔醫學縱橫,2001,17（2）：116-118.

LU Yan-qin,ZHANG Su-yin,REN Li-feng,et al.The relationship between stress and osteoclast appearance in periodontal of ratmolar in orthodontic tooth movement[J].J Comprehensive Stomatol, 2001,17（2）：116-118.

[16] 徐宇紅,劉媛媛,劉建國,等.不同正畸力作用下大鼠正畸牙牙周組織的組織學變化[J].貴州醫藥,2006,30（5）：405-406.

XU Yu-hong,LIU Yuan-yuan,LIU Jian-guo,et al.The histological change of periodontal tissue of orthodontics tooth in rats under different orthodontics force[J].Guizhou Medical J,2006,30（5）：405-406.

[17]羅玲,稅樺樺,徐小梅,等.大鼠正畸性牙根吸收及牙齒移動差異的研究[J].口腔醫學,2008,28（12）：620-622.

LUO Ling,SHUI Hua-hua,XU Xiao-mei,et al.Study on orthodontic root absorption and tooth movement discrepancy in rats[J]. Stomatology,2008,28（12）：620-622.

[18] Bègue-Kirn C,Krebsbach PH,Bartlett JD,et al.Dentin sialoprotein,dentin phosphoprotein,enamelysin and ameloblastin：Toothspecific molecules that are distinctively expressed during murine dental differentiation[J].Eur JOral Sci,1998,106（5）：963-970.

[19] Balducci L,Ramachandran A,Hao J,et al.Biological markers for evaluation of root resorption[J].Arch Oral Biol,2007,52（3）：203-208.

[20] Ruch JV.Odontoblast commitment and differentiation[J].Biochem Cell Biol,1998,76（6）：923-938.

（本文編輯 李彩）

Relationship between orthodontics root resorption follow ing experimental tooth movement and the level of dentin sialoph-osphoprotein and dentin sialoprotein in gingival crevicular fluid

ZUO Zhi-gang1,HU Min1,JIANG Huan1,TIAN Li2.（1.Dept.of Orthodontics,College of Stomatology,Jilin University,Changchun130021,China;2.Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering,The Ministry of Education,Jilin University,Changchun130021,China）

ObjectiveTo investigate the relationship of expression of dentin sialoph-osphoprotein（DSPP）and dentin sialoprotein（DSP）in gingival crevicular fluid（GCF）with root resorption following experimental tooth movement in rats. Methods 36 Wistar rats were divided into 3 groups on average randomly:Control group,light force group and heavy force group.The experimental teeth were drawn-off mesially by the force of 0.392N in light force group and 0.98N in heavy force group,with both of the maxillary central incisors as the tooth of anchorage.At the 7th day,the gingival crevicular fluid of rats were collected;the histological slices were made,including the experimental tooth and periodontal tissue;the tissues was stained with hematoxylin-eosin（HE）staining and tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）staining to observe the histological changes of the root resorption of rats.Then the expression of DSPP and DSP were assayed by using biochemistry techniques of Western blot.Results Histological observation:There was not root resorption in control group.Neither root resorption nor cementoclast was observed in light force group.And in heavy force group visible root resorption came out in pressure zone.Western blot results:There was expression of DSPP and no DSP in control group,and there was the expression of DSPP and DSP in both light force group and heavy force group. The result of statistical analysis showed that there were significant differences in the expression of DSPP and DSP among three groups.The highest one was heavy force group,followed by the light force group and control group with the least amount of proteins.ConclusionThere is the expression of DSPP and DSP in gingival crevicular fluid following experimental tooth movement with root resorption.

root resorption； gingival crevicular fluid； dentin sialoph-osphoprotein； dentin sialoprotein

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.019

1000－1182（2011）03－0294-05

2010-07-23；

2010-09-10

吉林省科技廳基金資助項目（20080042-1）

左志剛（1982—），男，河北人，住院醫師，碩士，現在天津醫科大學口腔醫院正畸科工作

胡敏，Tel：0431-85579339