白假絲酵母菌對人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞增殖的誘導作用

張琳 車團結 史曉艷 何祥一

（1.蘭州大學口腔醫學院 口腔修復研究室；2.蘭州大學生命科學院 細胞生物學研究所，蘭州 730000）

白假絲酵母菌對人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞增殖的誘導作用

張琳1車團結2史曉艷1何祥一1

（1.蘭州大學口腔醫學院 口腔修復研究室；2.蘭州大學生命科學院 細胞生物學研究所，蘭州 730000）

目的 研究白假絲酵母菌（S.albicans）對人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞增殖及細胞周期的影響。方法 體外培養ECV304，實驗分為S.albicans上清液組、S.albicans滅活菌液組、上清液和滅活菌液混合組、對照組。采用MTT法、細胞計數法、倒置顯微鏡及流式細胞術分別觀察各組對ECV304細胞增殖及細胞周期的影響。結果 在不同濃度、不同時間的培養條件下，4倍稀釋的S.albicans上清液在培養48 h能顯著促進細胞增殖；倒置顯微鏡觀察發現4倍稀釋的S.albicans上清液實驗組細胞密度明顯增高；上清液和滅活菌液分別作用細胞40h后，上清液組細胞S期、G2/M期所占百分比顯著升高，增殖指數（PI）增高，與對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。而滅活菌液組的PI值無顯著性差異（P＞0.05）。結論S.albicans的代謝產物可引起ECV304細胞的增殖。

白假絲酵母菌； 增殖； 代謝產物； 細胞周期

酵母菌為條件致病菌，可寄生于正常人皮膚或口腔黏膜表面。當有全身或局部誘發因素如有營養攝入不足、長期使用廣譜抗生素或免疫抑制劑、長期配戴活動義齒等條件時易誘發口腔黏膜感染。

自Jepsen等在口腔黏膜白斑的上皮角質層中找到酵母菌的菌絲以來[1]，白假絲酵母菌（Saccharomyces albicans,S.albicans）與口腔白斑的關系引起國內外學者廣泛關注。口腔白假絲酵母菌性白斑又稱口腔慢性增殖性白假絲酵母菌病（chronic hyperplasticSaccharomyces albicans，CHS），是口腔白斑伴有酵母菌慢性感染，屬于角化型癌前病變。研究[2-3]發現：在口腔酵母菌菌群中，S.albicans是最常見的病原體，約占67%～80%。流行病學的調查[4]顯示：口腔白斑患者中，S.albicans的檢出率為34%，受S.albicans感染過的動物可建立白斑動物模型。病理觀察[5]發現：白斑伴有上皮細胞異常增生時，其惡變潛能隨上皮細胞異常增生程度的增加而增大。這些研究表明：侵入上皮的S.albicans不僅并發感染引起炎性反應，還有可能引起上皮增殖形成白斑。S.albicans在口腔白斑發病過程中的致病機制尚無定論，目前主要集中在研究S.albicans與上皮關系的層面上，如Zhu等[6]闡述了S.albicans黏附機制和入侵黏膜上皮細胞的分子機制。本研究采用體外培養人臍靜脈內皮細胞ECV304的實驗方法來模擬人口腔黏膜上皮細胞，利用S.albicans培養上清液及其滅活菌體處理成分與細胞共培養，觀察其對細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

S.albicansATCC 90028（由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室惠贈）。ECV304購自中國科學院上海藥物研究所；MTT（批號9710）（Sigma公司，美國）；RPMI 1640培養基（Gibco公司，美國），新生小牛血清（杭州四季青生物公司）。

1.2 方法

1.2.1S.albicans上清液和滅活菌液的制備 將S. albicans在37℃沙堡氏液體培養基中振蕩培養48 h后，并高速離心（4 000 r·min-1、30min）。上清液用0.22μm濾膜2次過濾除菌后得到S.albicans上清液；10%甲醛溶液固定菌沉淀5 d，磷酸緩沖液洗2次后稀釋沉淀物至每毫升5×106CFU，即得S.albicans滅活菌液，備用。

1.2.2 實驗分組 1）S.albicans上清液組：作用時間恒定（40h）、不同作用濃度（RPMI 1640細胞培養液倍比稀釋S.albicans上清液為3個實驗終濃度1×、4×、16×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時間（24、48、72 h）。2）S.albicans滅活菌液組：作用時間恒定（40 h）、不同作用濃度（RPMI 1640細胞培養液倍比稀釋S.albicans滅活菌液為3個實驗終濃度1×、4×、16×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時間（24、48、72 h）。3）上清液和滅活菌混合組，即將4×稀釋的上清和滅活菌分別按1∶2、2∶1進行混合：作用時間恒定（40 h）、不同作用濃度（RPMI 1640細胞培養液倍比稀釋上清液加滅活菌混合液為3個實驗終濃度4×、16×、64×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時間（24、48、72 h）。4）對照組：加入等量完全培養基。

1.2.3 ECV304細胞傳代培養 ECV304細胞來源于健康產婦正常娩出的胎盤游離端臍帶，分離臍靜脈后得到的永生內皮細胞株。早在1984年國外已有學者應用其進行感染菌與宿主細胞交互作用方面的實驗探索[7]。因缺乏正常口腔黏膜細胞系的來源，而臍帶內皮細胞具有與口腔黏膜細胞最為接近的生理特性，故本實驗用ECV304模擬人口腔黏膜上皮細胞。

復蘇凍存的ECV304細胞，在含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養基中，37℃、5%CO2、95%空氣及飽和濕度的培養箱中培養。每2～3 d更換1次培養基，當細胞長滿瓶壁的80%以上時傳代。收獲指數生長期的ECV304細胞，備用。

1.2.4 MTT法測定ECV304細胞增殖率 用完全培養基調整細胞密度至每毫升1×105個，接種于96孔板，每孔100mL，設3個平行。24 h細胞完全貼壁進入對數生長期后，將上清液、滅活菌液（1×、4×、16×）；上清加滅活菌液（2∶1）、上清加滅活菌液（1∶2）（4×、16×、64×），每孔10μL分別加入細胞中。37℃培養40 h后，每孔加入MTT（5mg·mL-1）10μL，繼續培養4 h后棄去孔內液體，加入10%SDS液每孔120μL，置于培養箱中12 h后，EL340酶聯免疫儀在490 nm單波長下測定每孔的吸光度A值。每組設5孔平行。細胞增殖率（%）=（實驗組吸光度A值-對照組吸光度A值）/對照組吸光度A值×100%。

1.2.5 細胞計數法測定ECV304細胞增殖變化 用完全培養基調整細胞密度至每毫升5×104個接種于6孔板，每孔2mL。24 h細胞完全貼壁進入對數生長期后加入4×上清液、4×滅活菌懸液、16×上清加滅活菌液（2∶1）、16×上清加滅活菌液（1∶2），每孔200μL。置于培養箱中分別培養24、48和72 h后取出，胰酶消化后細胞計數，每組設3孔平行。

1.2.6 光鏡密度觀察ECV304細胞 ECV304細胞以每毫升5×104個密度接種在6孔板中，培養24 h后分別加入4×上清液、4×滅活菌懸液，40 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞密度變化。

1.2.7S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細胞周期的影響 將ECV304細胞置于10mL完全培養液中培養24 h，細胞貼壁進入對數生長期后，加入1mL的4×上清液、4×滅活菌懸液、另設單獨培養的細胞為對照。繼續培養40 h后，2.5 g·L-1胰酶消化細胞，收集于離心管中，PBS洗2次，加入碘化丙啶染液，避光4℃作用30min，流式細胞儀收集檢測細胞DNA周期。軟件分析G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分數，每組實驗均設3個平行。增殖指數（proliferation index，PI）（%）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G1/M）×100%。

1.2.8 統計學分析 結果用均數±標準差表示。應用SPSS 13.0軟件包進行分析，分別對各個實驗組進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 S.albicans上清液與滅活菌液對ECV304細胞增殖作用的影響

不同濃度的S.albicans上清液與滅活菌液對ECV 304細胞增殖作用的影響見表1，由表1可見，不同稀釋濃度的上清液，當作用時間為40 h時均可促細胞增殖，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）；不同稀釋濃度的滅活菌液對細胞增殖的作用，在4×滅活菌液時，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。但在原倍（1×）和高倍（16×）稀釋時，經檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 上清液和滅活菌液作用40 h后對ECV304細胞增殖的影響Tab 1 The effect of S.albicans supermatant and inactivated bacilli on cell proliferation of ECV304 after 40 h

2.2 S.albicans上清液加滅活菌混合液對ECV304細胞增殖作用的影響

不同濃度的S.albicans上清液加滅活菌混合液對ECV304細胞增殖作用的影響見表2，由表2可見，上清液和滅活菌的混合液作用細胞40 h后，隨著稀釋倍數的增大，促細胞增殖率逐漸降低。當上清液加滅活菌液（2∶1）作用細胞時，在較低稀釋倍數（4×、16×）時，明顯促細胞增殖，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。但當稀釋倍數增大到64×時、上清液加滅活菌液（1∶2）的混合液作用后無明顯變化（P＞0.05）。

表2 上清液和滅活菌混合液作用40 h后對ECV304細胞增殖的影響Tab 2 The effect of S.albicans supermatant and inactivated bacillim ixture on cell proliferation of ECV304 after 40 h

2.3 S.albicans不同組分在不同培養時間下對ECV304細胞增殖作用的影響

S.albicans不同組分在不同培養時間下對ECV304細胞增殖作用的影響見圖1。

圖1 各組對ECV304細胞生長影響的曲線圖Fig 1 The influence of each component on the growth of ECV304

由圖1可見，用細胞計數法測定一定濃度的S. albicans不同組分分別作用ECV304細胞24、48、72h，隨著時間增長，4×上清液和4×滅活菌液在不同時間較正常對照組均有不同程度的增殖。其中4×上清液在作用24、48 h時，與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。但72h時，與正常相比無明顯變化（P＞0.05）；4×滅活菌液在作用48 h時對細胞有顯著促進增殖的作用（P＜0.05），而在24 h和72 h則無明顯變化（P＞0.05）。與對照組相比，16×上清和滅活菌的混合液在各個作用時間均對細胞無明顯促進增殖的作用（P＞0.05）。

2.4 S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細胞密度變化的影響

ECV304細胞經不同實驗組處理40 h后（圖2），4倍稀釋的滅活菌液組（圖2C）與對照組（圖2A）細胞密度相當，4倍稀釋的S.albicans上清液組（圖2B）細胞密度明顯高于4倍稀釋的滅活菌液組與對照組。

2.5 S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細胞周期的影響

S.albicans的上清液和滅活菌液在作用ECV304細胞40 h后，各實驗組細胞周期時相結果見表3。與對照組相比，上清液組G0/G1組細胞所占比例降低，S期、G2/M期所占百分比顯著升高，反映細胞增殖活力指數PI增高，經統計學檢測S期和G2/M期與對照組間差異有顯著性（P＜0.05）。而滅活菌組的細胞PI值與對照組相比無明顯變化（P＞0.05）。

圖2 不同組作用40 h后ECV304細胞密度變化 倒置顯微鏡 ×100Fig 2 The changes in cell density of ECV304 for 40 hours by different groups inverted microscope ×100

表3 上清液和滅活菌液對ECV304細胞細胞周期的影響Tab 3 The effect of S.albicans supernatant and inactivated bacteria on cell cycle distribution of ECV304

3 討論

許多研究從體外實驗和動物實驗等方面闡述了S.albicans有很大的致病潛力，但S.albicans致病機制尚無定論[8]。在人和動物假絲酵母菌病中，盡管菌絲成分未侵入角質層以下，但在上皮內和上皮下的組織都發生了明顯的改變[9]。病變區上皮較其他白斑厚，上皮深層增生顯著，有絲分裂增加，常出現錯角化。張凌等[10]采用流式細胞儀觀察白假絲酵母菌對口腔上皮細胞的增殖及細胞周期的影響，發現菌絲型白假絲酵母菌可改變口腔上皮細胞周期。促增殖的因素可以是菌體本身，也可能是活菌產生的代謝產物所致。但對此方面深入的研究，國內尚無報道。本研究提取S.albicans上清液和滅活菌液分別作用細胞，采用MTT法進行橫向比對（固定時間，不同作用濃度），細胞計數法進行縱向比對（固定濃度、不同作用時間），以及細胞密度觀察，流式細胞術研究S. albicans代謝產物和菌體自身對細胞增殖作用的影響，以解析S.albicans的致病性。

研究結果顯示：在固定時間，不同作用濃度的實驗條件下，較高濃度上清液和滅活菌液可促使細胞增殖，上清液是主要因素。在固定濃度、不同作用時間的實驗條件下，在實驗早期（0～48 h），不同組分對細胞促增殖影響基本呈正相關，以上清液促增殖最為明顯，在作用時間為48 h時，促細胞增長達到最大。一定濃度滅活菌液在作用48 h時，與對照相比，也有促增殖影響。延長培養時間至72 h，發現實驗組和對照組均已無顯著差異。可能的原因是隨著時間的增長，上清液和滅活菌液促細胞增殖的活性物質發生了降解。也可能由于培養時間過長，細胞在6孔板有限的競爭空間不足有關。

倒置顯微鏡觀察結果顯示：ECV304細胞經不同實驗組處理40 h后，上清液作用的細胞密度顯著高于正常組和滅活菌液組，說明上清液對細胞增殖產生了影響。

細胞周期中G1期是DNA合成前期，主要包括RNA和DNA聚合酶的合成。S期是DNA合成期，G2/M期是DNA合成后期，主要進行RNA及蛋白質的合成。增殖旺盛的細胞處于S期和G2/M期比例較高。本研究結果顯示：上清液組G0/G1期細胞所占比例降低，S期、G2/M期所占百分比顯著升高，反映細胞增殖活力指數PI增高（P<0.05）。而滅活菌液組的細胞PI值與對照組相比無明顯變化。說明當上清液、滅活菌液分別作用細胞時，上清液仍是主要促細胞增殖因素。

高巖等[11]對假絲酵母菌性白斑的研究表明：假絲酵母菌白斑的上皮較其他白斑的上皮厚，有絲分裂增多，DNA合成較多，細胞周期時間縮短；上皮層次紊亂，部分基底細胞極性消失，核大而濃染，細胞呈現多形性。提示白假絲酵母菌的慢性感染可導致細胞分裂活動增加，最終引起黏膜增生。這與本實驗發現白假絲酵母菌上清液可誘導ECV304細胞增殖的結果相符合。

S.albicans黏附并成功定植在宿主黏膜表面是其致病的第一步，也是最關鍵的一步。近年來，關于S. albicans黏附、入侵黏膜內皮進而感染機體的機制性研究也開展了許多。Dalle等[12]研究發現：S.albicans入侵上皮細胞并感染機體不僅取決于S.albicans的形態和活力，也在于上皮細胞的形態和對微生物的敏感性。本實驗的研究表明：白假絲酵母菌的代謝產物對內皮細胞增殖有誘導作用，但其機制還有待于進一步的研究。

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（本文編輯 湯亞玲）

A study on hum an umbilical vein endothelial cell ECV304 proliferation induced by Saccharomyces albicans

ZHANG Lin1,CHE Tuan-jie2,SHI Xiao-yan1,HE Xiang-yi1.（1.Dept.of Prosthodontics,School of Stomatology,Lanzhou University,Lanzhou730000,China;2.Cell Biology Institute,School of Life Science,Lanzhou University,Lanzhou730000,China）

ObjectiveTo study the effects ofSaccharomyces albicans（S.albicans）on the cell cycle distribution and proliferation of human umbilical vein endothelial cell ECV304 cellsin vitro.MethodsThe line of ECV304 culturedin vitrowere divided into four groups which were treated byS.albicanssupernatant,S.albicansinactivated bacilli,supernatant and inactivated bacillimixture,normal culture medium.The proliferous effect of ECV304 induced by supernatant, inactivated bacilli,supernatant and inactivated bacilli mixture using the methods of MTT,cell count,microscope and flow cytometry were conducted.Results In the condition of different times and different culture concentrations,ECV304 cells incubated with 4-fold dilutedS.albicanssupernatant for 48h increased the proliferation rate.The S and G2/M population of ECV304 cells increased after incubated withS.albicanssupernatant for 40h,which showed significant increasing cell proliferation index（PI）（P＜0.05）.The PI of the cells treated by inactivated bacilli showed no significant change（P＞0.05）.ConclusionS.albicanscould induce ECV304 cell proliferation which depends on the release of metabolic products ofS.albicans.

Saccharomyces albicans； proliferation； metabolic product； cell cycle

R 781.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.018

1000－1182（2011）03－0289-05

2010-06-19；

2010-12-21

甘肅省科技攻關計劃基金資助項目（0709TCYA053）

張琳（1983—），女，陜西人，碩士

何祥一，Tel：13038730686