平陽霉素-活性炭納米微粒行口腔癌淋巴化療的靶向性評價

孫明磊 謝衛(wèi)紅 王昌美 溫玉明

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔頜面外科，鄭州 450052；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 頭頸腫瘤外科，成都 610041）

平陽霉素-活性炭納米微粒行口腔癌淋巴化療的靶向性評價

孫明磊1謝衛(wèi)紅1王昌美2溫玉明2

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔頜面外科，鄭州 450052；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 頭頸腫瘤外科，成都 610041）

目的 觀察平陽霉素-活性炭納米微粒（PYM-CH-NP）經(jīng)鼠癌周黏膜下給藥后，活性藥物在體內(nèi)各組織器官中的分布情況，探討PYM-CH-NP對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向性。方法 采用改良氯胺T法將125I標(biāo)記平陽霉素（PYM），應(yīng)用淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移癌株U14建立昆明小鼠頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。將360只頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型小鼠隨機分為PYM-CH-NP組、PYM組和陰性對照組，分別于癌周黏膜下注射PYM-CH-NP、PYM水溶液和空白活性炭納米微粒，給藥后0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h處死動物，取血、心、肝、脾、肺、腎和頸淋巴結(jié)，檢測各時間點各組織器官內(nèi)平陽霉素的放射活性，計算各樣本單位重量的藥物放射活性（比放射活性），并計算藥物的選擇性指數(shù)（SI）和靶向指數(shù)（TI）。結(jié)果 PYM-CH-NP組各時間點頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度顯著高于PYM組（P＜0.001），4 h后血、心、肝、脾、肺、腎等器官中藥物濃度均低于PYM組（P＜0.001）。PYM組各時間點的SI均小于1，而PYM-CH-NP組SI和TI最低值為1.793和1.562，最高為72 h時的68.126和14.623。結(jié)論 PYM-CH-NP可顯著增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的藥物濃度，同時非靶器官藥物分布減少，降低了藥物的全身毒副反應(yīng)。

活性炭； 納米微粒； 平陽霉素； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移； 靶向治療

癌細胞的擴散和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因，由于口腔頜面部淋巴循環(huán)豐富，口腔癌易早期發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，成為影響患者預(yù)后的重要因素之一，因此豐富和提高頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療手段成為提高患者生存率的重要措施。前期研究中，本課題組經(jīng)體外實驗證實平陽霉素-活性炭納米微粒（pingyangmycin-activated carbon nanoparticles，PYM-CHNP）保留了平陽霉素（pingyangmycin，PYM）的抗癌活性并具有緩釋性[1]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過建立頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型，探討PYM-CH-NP經(jīng)癌周黏膜下注射后對頸淋巴結(jié)的靶向性。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑、細胞系及動物

平陽霉素標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%，中國食品藥品檢定研究院），注射用鹽酸平陽霉素（哈爾濱博萊制藥有限公司，批號03080201），PYM-CH-NP（平均粒徑178 nm，PYM與CH-NP按1∶10質(zhì)量比吸附，四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室制備）。標(biāo)記用放射性同位素125I-NaI（放射性濃度為388mCi·mL-1，NEN Life Science Products公司，美國）。氯胺T（分析純，化學(xué)純度98%，上海松江余山化工廠），偏重亞硫酸鈉（分析純，上海試劑四廠），碘化鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。Sephadex G-15層析柱（Pharmacia公司，美國）。小鼠宮頸癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移癌株U14（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心免疫學(xué)教研室提供）。昆明小鼠360只，雌雄各半，鼠齡6～8周，重22～25 g（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心動物實驗中心提供）。

1.2 實驗儀器

BSZ-160自動部分收集器（上海滬西儀器廠），F(xiàn)H 463-A自動定標(biāo)器（北京核儀器廠），XH-6010γ放射免疫計數(shù)器（西安核儀器廠），旋渦混合器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠），Sartorious-1712型電子天平（賽多利斯公司，德國）。

1.3 實驗方法

1.3.1125I標(biāo)記平陽霉素 采用改良氯胺T法標(biāo)記平陽霉素。將平陽霉素標(biāo)準(zhǔn)品1mg、125I-NaI 3mCi、氯胺T 1mg混合，室溫振搖150 s后立即上層析柱分離，用淋洗緩沖液淋洗，速度為0.5mL·min-1，收集樣品，檢測放射活性，制備淋洗曲線，檢測125I-PYM的峰值，紙層析法計算該標(biāo)記物的放射化學(xué)純度和標(biāo)記率。

1.3.2 頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型的建立 用小鼠宮頸癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移癌株U14懸液（5×109·L-1）行昆明小鼠雙側(cè)頰黏膜下注射，每側(cè)0.1mL，建立頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型。

1.3.3 實驗分組 將360只頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型小鼠隨機分為3組：PYM-CH-NP組、PYM組和陰性對照組，每組120只小鼠。PYM-CH-NP組小鼠用PYM-CH-NP按含PYM 10mg·kg-1的劑量（含標(biāo)記PYM 5μCi）行癌周黏膜下注射，PYM組用PYM水溶液10mg·kg-1（含標(biāo)記PYM 5μCi）行小鼠癌周黏膜下注射，陰性對照組癌周注射等量的空白活性炭納米微粒。然后再將每組各平分為12個小組（每小組10只小鼠），分別于注藥后0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h斷頸處死小鼠，摘眼球取血，解剖留取心、肝、脾、肺、腎和頸部淋巴結(jié)。

1.3.4 小鼠血及各器官中藥物放射活性的測定 將小鼠血液盛入肝素化的試管內(nèi)，計量、稱重，將心、肝、脾、肺、腎和頸部淋巴結(jié)用生理鹽水沖洗后，濾紙吸干水分稱重，編號，用γ放射免疫計數(shù)器測量放射活性（cpm），計算各樣本單位重量的藥物放射活性，即比放射活性（cpm·mg-1），該數(shù)值代表樣本單位重量中平陽霉素的劑量，代表藥物濃度。

1.3.5計算PYM和PYM-CH-NP的選擇性指數(shù)和PYMCH-NP的靶向指數(shù) 根據(jù)各時間點在血和淋巴結(jié)中的藥物含量，依據(jù)選擇性指數(shù)（selectivity index，SI）和靶向指數(shù)（targeting index，TI）來考察PYM-CH-NP的淋巴靶向性。SI=淋巴結(jié)中的藥物比放射活性/血中的藥物比放射活性；TI=PYM-CH-NP組淋巴結(jié)的藥物比放射活性/PYM組淋巴結(jié)的藥物比放射活性。

2 結(jié)果

2.1 125 I-PYM的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度

采用改良氯胺T法標(biāo)記平陽霉素，制備淋洗曲線，共有2個放射峰，第1個峰為125I-PYM，第2個峰為125I-NaI（圖1）。紙層析法測得125I-PYM的放射化學(xué)純度為96.3%。經(jīng)計算，標(biāo)記率為65%～82%。

圖1 125 I標(biāo)記平陽霉素的淋洗曲線Fig 1 Elution curve of pingyangmycin radiolabeled with 125 I

2.2 小鼠癌周黏膜下注藥后各時間點體內(nèi)血和各器官中平陽霉素的比放射活性

小鼠癌周黏膜下注藥后各時間點體內(nèi)血和各器官中平陽霉素的比放射活性見表1、2。從表1、2中可知：1）PYM組各時間點血中及其他器官內(nèi)均有較高的藥物濃度，淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度低于血和腎臟中藥物濃度（P＜0.05），高于心臟中的藥物濃度（P＜0.05），48 h后高于脾、肺中的藥物濃度（P＜0.001）；PYMCH-NP組各時間點頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度均顯著高于血和其他器官內(nèi)的藥物濃度（P＜0.001），持續(xù)至168 h頸淋巴結(jié)內(nèi)仍有較高的藥物濃度，而血和其他器官內(nèi)的藥物濃度在4 h后已降至很低。2）PYM-CH-NP組各時間點頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度顯著高于PYM組（P＜0.001），尤其表現(xiàn)在12 h后，PYM-CH-NP組頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度遠遠高于PYM組，而PYM組注藥12 h后頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度明顯趨于降低；PYM-CH-NP組4 h后各時間點血、心、肝、脾、肺、腎等器官中藥物濃度均低于PYM組（P＜0.001）。陰性對照組未檢測到藥物濃度。

表1 小鼠癌周黏膜下注射PYM各時間點血及各器官中平陽霉素的比放射活性Tab 1 Specific radioactivity of pingyangm ycin in plasma and organs of the m ice after submucosa ad jacent cancer injection of pingyangmycin water solution cpm·mg-1

表2 小鼠癌周黏膜下注射PYM-CH-NP各時間點血及各器官中平陽霉素的比放射活性Tab 2 Specific radioactivity of pingyangm ycin in plasma and organs of the m ice after submucosa ad jacent cancer injection of PYM-CH-NP cpm·mg-1

2.3 靶向性分析

根據(jù)表1、2計算出PYM-CH-NP和PYM組注射后各時間點頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的SI和TI見表3。由表3可見：PYM組注射后各時間點頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的SI均小于1，表明無淋巴靶向性，而PYM-CH-NP組注射后各時間點頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的SI均大于1，TI也大于1，在24～72 h時TI和SI趨于最高，反映出良好的淋巴靶向性。

表3 PYM-CH-NP和PYM注射后各時間點頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的SI和TITab 3 TI and SI values of cervical lymph nodes after submucosa ad jacent cancer injection of PYM-CH-NP and PYMat each time point

3 討論

近年來，淋巴靶向治療作為靶向治療的一個新領(lǐng)域越來越受到重視，將藥物通過靶向給藥系統(tǒng)輸送至淋巴系統(tǒng)，直接發(fā)揮有效的治療作用，可極大提高治療效果，降低藥物的全身不良反應(yīng)。傳統(tǒng)的藥物不具備靶向作用，難以有效達到理想的靶向部位，如何將藥物導(dǎo)向臨床治療需要達到的靶向部位是提高藥物療效的關(guān)鍵。納米給藥系統(tǒng)（nanoparticles polymer delivery system，NPDs）有望解決這一難題，這類新型給藥系統(tǒng)粒徑介于10～1 000 nm，具有緩釋性、良好穩(wěn)定性和靶向性等優(yōu)點，在腫瘤靶向治療中具有獨特的優(yōu)勢和潛在的應(yīng)用價值[2]。本研究中PYM-CH-NP即為一種具備淋巴靶向的納米靶向給藥系統(tǒng)，有望提高藥物在淋巴靶向器官的生物利用度，降低全身不良反應(yīng)。

靶向給藥系統(tǒng)是根據(jù)臨床需要，通過選用對機體各種組織或病變部位具有親和力的載體制作載藥微粒，使藥物能夠輸送至治療期望到達的特定部位，以增加藥物在靶器官的分布，減少非靶器官的分布，達到提高療效、減少毒副作用的目的[3]。載體的靶向方式可分為4種。1）被動靶向：載體對靶細胞不具有識別能力，經(jīng)通常的生理途徑到達身體的某一或某些器官；2）主動靶向：載體具有識別能力，不被人體的單核細胞吞噬系統(tǒng)吞噬，能與特定的靶組織、靶細胞結(jié)合；3）物理化學(xué)靶向：利用溫度、磁場、pH等外加因素將載體靶向目標(biāo)部位；4）牽制靶向：用無藥載體或吞噬細胞抑制劑抑制單核細胞吞噬系統(tǒng)后再導(dǎo)入含藥載體，提高其靶向性，但因削弱了機體的免疫能力將導(dǎo)致不良后果。與主動靶向相比，被動靶向給藥的可能性和潛能一直為人們所低估，但仍具重要價值。因為首先機體絕大部分屬非靶部位，減少載藥微粒在非靶部位的特異性攝取是提高主動靶向的前提；其次主動靶向系統(tǒng)必須被動透過內(nèi)皮細胞才可發(fā)揮作用，故藥物載體的被動轉(zhuǎn)運是發(fā)揮后期作用的首要條件。另外主動靶向載體攜帶藥物時，一些被動性因素如交聯(lián)藥物對抗體產(chǎn)生不良理化作用、藥物-抗體交聯(lián)物被非特異性攝取等可能使定位給藥難以實現(xiàn)[4]。本研究中，活性炭納米微粒攜載藥物平陽霉素，通過黏膜下注射給藥，因載藥微粒粒徑小，通過被動靶向機理進入內(nèi)皮細胞間隙或通過內(nèi)皮細胞的吞噬和胞飲作用進入毛細淋巴管，經(jīng)淋巴引流進入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)，結(jié)合納米微粒的緩釋作用，可發(fā)揮對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶持續(xù)高濃度的治療作用，為一種良好的被動靶向制劑。

關(guān)于納米微粒靶向性的質(zhì)量評價目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究選用目前較為公認的2個靶向性評價指標(biāo)[5]，即SI和TI來評價PYM-CH-NP對頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向性。SI是指給予實驗動物載藥納米微粒后，靶器官藥物濃度與血液中藥物濃度之比。TI是指給予實驗動物載藥納米微粒和游離藥物后，載藥納米微粒靶器官藥物濃度與游離藥物靶器官藥物濃度之比[6]。當(dāng)TI和SI值大于1時，表明微粒對靶器官具有靶向性，其值越大，靶向性越強。本實驗中靶器官為淋巴結(jié)，藥物濃度采用藥物的比放射活性來代表。實驗結(jié)果顯示：PYM-CH-NP各時間點的SI和TI值最低也為1.793和1.562，而72 h時間點上的SI和TI值高達68.126和14.623，該時間點上靶向性最強。采用125I標(biāo)記藥物分子作為示蹤，可靈敏地反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)運、排泄等動態(tài)變化[7]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各時間點上PYM-CH-NP組在淋巴結(jié)內(nèi)的藥物量都明顯高于PYM組，在血及其他重要器官中的藥物分布都明顯低于PYM組，顯示了其良好的淋巴靶向性，同時降低了全身毒副作用。

[1] 孫明磊,王昌美,溫玉明.平陽霉素-活性炭納米微粒對口腔鱗癌細胞系Tca8113和BcaCD885細胞體外的殺傷作用[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,25（3）：257-260.

SUN Ming-lei,WANG Chang-mei,WEN Yu-ming.Anticancer effects of pingyangmycin-activated carbon nanoparticles against human oral squamous carcinoma Tca8113 and BcaCD885 cell lines in vitro[J].West China J Stomatol,2010,25（3）：257-260.

Lymphatic targeting study of pingyangm ycin-activated carbon nanoparticles treating oral cancer lymph node metastasis

SUN Ming-lei1,XIE Wei-hong1,WANG Chang-mei2,WEN Yu-ming2.（1.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou450052,China;2.Dept.of Head and Neck Oncology,West China School of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo investigate the drug distribution in tissues of cervical lymph node metastasis mice model after submucosa adjacent cancer injection of pingyangmycin-activated carbon nanoparticles（PYM-CH-NP）and evaluate the lymph targeting effect of PYM-CH-NP.MethodsPingyangmycin（PYM）was radiolabeled with125I by modified the chloramine T method.Cervical lymph node metastasis mice model was established by buccal submucosa inoculation of a high lymph metastasis cell line U14 cancer cell.360 mice models burdened with cervical lymph metastasis were randomly divided into 3 groups.PYM group was treated with PYM water solution,PYM-CH-NP group was treated with PYM-CH-NP.Negative control group was injected with activated carbon nanoparticles.PYM-CH-NP and pingyangmycin water solution were injected in pericancer submucosa of the mice respectively.The radioactivity of drug in blood, heart,liver,spleen,lung,kidney and cervical lymph node were measured after 0.5,1,4,8,12,24,48,72,96,120, 144,168 h administration.The radioactivity of each samples per unit weight were calculated.The selectivity index（SI）and targeting index（TI）of drug were calculated.Results The radioactivity of drug in cervical lymph node of PYMCH-NP group was much higher than PYM group in each time point（P<0.001）,whereas the blood,heart,liver,spleen, lung and kidney uptake of pingyangmycin was greatly decreased in PYM-CH-NP group after 4 h administration（P< 0.001）.The SI value of PYM group at each time point was less than 1.While the minimum SI and TI value of PYMCH-NP was 1.793 and 1.562,the maxlmum value reached to 68.126 and 14.623 after 72 h administration.ConclusionPYM-CH-NP can increase drug dosage in metastasized cervical lymph nodes,and decrease drug dosage of other organs.So better therapeutic outcome and little adverse reaction may be achieved for lymph node metastasis.

activated carbon； nanoparticle； pingyangmycin； lymph node metastasis； targeted therapy

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.008

1000－1182（2011）03－0253-04

2010-09-23；

2010-12-10

衛(wèi)生部科學(xué)研究基金資助項目（98-1-221）

孫明磊（1973—），男，河南人，副主任醫(yī)師，博士

溫玉明，Tel：028-85501488

·臨床研究·