磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路與正畸牙移動的關系

劉奕 王巖 孫素芬

（中國醫科大學口腔醫院 奉天門診，沈陽 110013）

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路與正畸牙移動的關系

劉奕 王巖 孫素芬

（中國醫科大學口腔醫院 奉天門診，沈陽 110013）

目的 探討磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶（AKt）信號通路與正畸牙移動的關系。方法 選用24只日本大耳白兔建立正畸牙移動的動物模型，將實驗動物上頜右側戴矯治器，作為實驗側；上頜左側未戴矯治器，作為對照側。分別在戴矯治器3、5、7、14 d后各處死6只實驗動物。用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RQ-PCR）及Western blot免疫印跡分析方法對PI3K、AKt表達的變化進行檢測。結果 RQ-PCR結果顯示：加力3 d后，牙周組織中PI3K、AKtmRNA表達增強；7 d后牙周組織中PI3K、AKtmRNA明顯增強，隨后緩慢下降，與對照側相比，其差異有統計學意義（P＜0.05）。Western blot免疫印跡分析與RQ-PCR結果一致。結論 正畸力作用下兔牙周組織中PI3K、AKt的表達增加。提示PI3K/AKt信號通路與正畸牙移動有關，PI3K/AKt信號通路參與正畸牙移動過程中的牙周組織改建。

磷脂酰肌醇-3-激酶； 蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶； 實時熒光定量聚合酶鏈反應

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶（proteinserine-threonine kinase，AKt）信號通路激活主要促進細胞增殖、細胞遷移以及血管生成[1-2]。目前在腫瘤領域研究較多，但PI3K/AKt信號通路與正畸牙移動及牙周組織改建關系的研究尚未見相關報道。本研究通過建立動物模型，觀察PI3K、AKt在牙周組織中的表達變化，探討PI3K/AKt信號通路在正畸牙移動中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗分組和動物模型的建立

選取由中國醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供的日本大耳白兔24只，體重為（2.0±0.2）kg，雌雄不限。所有實驗動物均定時、定量攝食，自由飲水。實驗動物上頜右側戴矯治器進行加力，作為實驗側；上頜左側未戴矯治器，作為對照側。喂養1周后，2%戊巴比妥鈉經耳緣靜脈麻醉（2mL·kg-1），使用牙科細金剛砂車針在實驗動物右側上頜第一磨牙和左、右側上頜切牙牙頸部磨溝，深約0.5mm，然后將左、右上頜切牙連扎，并在其與右側上頜第一磨牙間放置鎳鈦螺簧，以左、右側上頜切牙為支抗，牽引右側上頜第一磨牙向近中移動，力值為0.784N。在戴矯治器3、5、7、14 d后，經耳緣靜脈注入空氣，肺栓塞處死實驗動物，每次6只。取牙周組織進行實驗。

1.2 總RNA的提取及質量控制

依據RNA提取液和試劑盒說明提取凍結組織總RNA，去除骨膠原等雜質，在260 nm和280 nm波長紫外光下測定光密度值（A值），計算A260nm/A280nm值，測得純度為1.8±0.3。逆轉錄按實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）試劑盒說明進行。

1.3 引物設計

PI3K引物序列：上游5’-GCCCAGGCTTACTACAGAC-3’；下游5’-AAGTAGGGAGGCATCTCG-3’，擴增片段長度為236bp。AKt引物序列：上游5’-CTCATTCCAGACCCACGAC-3’；下游5’-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3’，擴增片段長度為242 bp。β-actin為參照，引物序列：上游5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’；下游5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，擴增片段長度為318 bp。

1.4 RQ-PCR產物檢測

采用熒光染料（SYBR Green）標記的RQ-PCR法檢測哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA的表達，以β-actin作為內對照，按逆轉錄試劑盒使用說明進行操作，選用olign（dT）作引物合成第一鏈cDNA，RQ-PCR檢測正畸力作用下PI3K和AKt在牙周組織中的表達變化。所有的逆轉錄產物在ABI Prism 7500HT序列檢測系統中運行。3次獨立樣本經過3次獨立實驗后得到的數據用公式RQ=2-△△Ct進行分析。

1.5 Western blot免疫印跡

將組織塊剪碎，懸于500μL冰冷緩沖液A（含有20mmol·L-1Triso-HCl、pH值為7.5的0.1 mmol·L-1Na3VO4、25mmol·L-1NaF、2mmol·L-1乙二胺四乙酸、2mmol·L-1乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1mmol·L-1DDT、1mmol·L-1苯甲基磺酰氟、2μg·mL-1胰蛋白酶抑制劑、1mmol·L-1亮抑蛋白酶肽）中，冰浴中將組織勻漿粉碎，4℃下18 000 r·min-1離心30min，吸取上清，棄沉淀，考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白濃度。上清用10%SDS-PAGE分離，然后轉移到聚偏氟乙烯膜上，經2h 50V的轉印后TTBS洗膜3次，每次5min。用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TTBS封閉，4℃過夜，再與抗PI3K、AKt抗體室溫孵育2 h，與相應的HRp標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，超敏化學發光試劑系統顯影。采用SPSS12.0統計分析軟件對數據進行分析，配對t檢驗分析Western blot結果。

2 結果

2.1 RQ-PCR結果

正畸施力3 d后，PI3K、AKtmRNA表達開始增強，7 d出現高峰，14 d呈下降趨勢（圖1、2）。其中7 d時，實驗側與對照側PI3KmRNA灰度值比為4.04∶1，實驗側與對照側AKtmRNA灰度值比為4.35∶1，實驗側與對照側PI3K、AKt相比差異有統計學意義（P＜0.01）。在3、5、7、14 d，實驗側與對照側PI3K、AKt相比差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 RQ-PCR檢測PI3KmRNA在牙周組織中的表達Fig 1 Expression of the PI3K mRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

圖2 RQ-PCR檢測AKtmRNA在牙周組織中的表達Fig 2 Expression of the AKtmRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

2.2 Western blot免疫印跡結果

施力牙周組織中PI3K、AKt蛋白表達量明顯高于對照側，尤其第7天時，隨后又呈下降趨勢（圖3、4）。經灰度值分析（圖5、6）：施力7 d時，實驗側PI3K、AKt的表達量分別為對照側的3.51、5.42倍。3、5、7、 14 d時，實驗側PI3K、AKt與對照側比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中第7天差異顯著（P<0.01）。

圖3 PI3K的Western blot免疫印跡結果Fig 3 Results of Western blot analysis of PI3K

圖4 AKt的Western blot免疫印跡結果Fig 4 Results of Western blot analysis of AKt

圖5 PI3K的Western blot免疫印跡結果的灰度值分析Fig 5 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of PI3K

圖6 AKt的Western blot免疫印跡結果的灰度值分析Fig 6 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of AKt

3 討論

牙頜畸形的矯治必須對錯位的牙、牙弓或頜骨施加一定的矯治力，以引起牙周組織、頜骨在生理限度內的組織改建，這樣才能使牙移動，恢復或重建咬合平衡，從而使牙頜系統獲得理想的外形，發揮正常的功能，達到矯治畸形的目的[3]。骨的生長與代謝直接或間接的影響正畸療效，因此，必須深入研究正畸力作用下牙移動的分子機制，尋求更有效的方法，縮短療程，減輕患者的負擔。

mTOR作為一種重要的調節基因，通過調節細胞周期、蛋白質合成、細胞能量代謝等多種途徑發揮重要的生理功能，在細胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調控點的作用[4-6]。筆者圍繞mTOR的上下游做了大量工作。在前期研究中，檢測到正畸牙移動時，在兔牙周組織中mTOR及其下游底物p70 S6K的表達明顯增強，提示mTOR和p70 S6K參與牙周組織改建，并在牙周組織改建中起作用[7-8]。

mTOR通過PI3K/AKt/mTOR信號通路調控細胞的生長和增殖。AKt可直接磷酸化mTOR的Ser2448位點，激活mTOR和它的下游途徑，控制著細胞增殖和轉化所需特殊蛋白質的翻譯。PI3K/AKt信號途徑現被認為是真核細胞生長和增殖的關鍵信號途徑[9]。PI3K/ AKt/mTOR信號通路調控細胞的生長與增殖。成骨細胞的前體細胞即間充質干細胞主要存在于骨骼系統中，在一定的條件下可以通過核心結合因子基因的激活誘導成骨分化。應用雷帕霉素阻斷該通路在成骨細胞中的活化，觀察到成骨細胞的分化明顯受到了抑制。表現在鈣質沉積的茜西紅染色減弱，顯示成骨細胞分化能力明顯下降[10]。表明PI3K/AKt/mTOR信號通路的活化在成骨前體細胞的分化過程中起作用。

本實驗檢測了mTOR的一條主要上游通路PI3K/ AKt的表達。結果表明PI3K、AKt在正畸施力3 d后表達增強，7 d達高峰，而14 d后有下降趨勢，推測：正畸力激活成骨細胞，成骨細胞自身產生激肽和生長因子，正反饋激活自身活化，通過生長因子調控PI3K/ AKt/mTOR信號通路，最終影響成纖維細胞、成骨細胞及破骨細胞蛋白的合成、轉錄過程，產生一系列的生物效應，最終引發正畸牙齒移動。正畸牙移動依賴于牙槽骨的改建，這一改建過程存在一個多因素的調控體系。PI3K、AKt在矯治力作用下的牙周組織改建過程中表達明顯增強，證明PI3K、AKt參與正畸牙齒移動過程中的牙周組織改建。改建過程需要合成更多的蛋白，PI3K、AKt的表達增強就是為大量合成蛋白質打基礎。關于PI3K/AKt信號通路與正畸力作用下牙周組織改建關系的研究，將會進一步提示正畸力作用下牙周組織改建的發生機制，并為臨床加速正畸牙移動提供有效的理論依據。

[1] Xu G,Zhang W,Bertram P,et al.Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN-AKT-mTOR pathway in common human tumors [J].Int J Oncol,2004,24（4）：893-900.

[2] Saji M,Ringel MD.The PI3K-Akt-mTOR pathway in initiation and progression of thyroid tumors[J].Mol Cell Endocrinol,2010, 321（1）：20-28.

[3] 趙秀敏,艾紅軍,常新.成骨細胞和破骨細胞的傳導通路和相關因子[J].中國實用口腔科雜志,2009,2（3）：176-179.

ZHAO Xiu-min,AI Hong-jun,CHANG Xin.The transduction pathway of osteoblasts and osteoclasts and related factors[J].Chin J Pract Stomatol,2009,2（3）：176-179.

[4] Fingar DC,Blenis J.Target of rapamycin（TOR）：An integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression[J].Oncogene,2004,23（18）：3151-3171.

[5] Asnaghi L,Bruno P,Priulla M,et al.mTOR：A protein kinase switching between life and death[J].Pharmacol Res,2004,50（6）：545-549.

[6] Liu Y,Hidayat S,Su WH,et al.Expression and activity ofmTOR and its substrates in different cell cycle phases and in oral squamous cell carcinomas of different malignant grade[J].Cell Biochem Funct,2007,25（1）：45-53.

[7] 劉奕,郭亞鋒.正畸力作用下兔牙周組織中雷帕霉素靶蛋白和核糖體蛋白S6激酶的表達[J].華西口腔醫學雜志,2008,26（6）：580-583.

LIU Yi,GUO Ya-feng.Expression ofmammalian target of rapamycin and p70 S6 kinase in rabbit periodontal tissues remodeling during orthodontic tooth movement[J].West China JStomatol,2008, 26（6）：580-583.

[8] 劉奕,畢瑋瑋.矯治力對兔牙周組織中雷帕霉素靶蛋白和核糖體S6蛋白激酶活性的影響[J].中國醫科大學學報,2008,37（3）：359-360.

LIU Yi,BIWei-wei.Effect of Orthodontics on mammalian target of rapamycin and p70 S6 kinase in rabbit periodontal tissues[J]. J China Medical University,2008,37（3）：359-360.

[9] Hay N,Sonenberg N.Upstream and downstream ofmTOR[J].Genes Dev,2004,18（16）：1926-1945.

[10]Saji M,Ringel MD.The PI3K-Akt-mTOR pathway in initiation and progression of thyroid tumors[J].Mol Cell Endocrinol,2010, 321（1）：20-28.

（本文編輯 胡興戎）

The relationship between phosphatidylinositol-3-kinases/protein-serine-threonine kinase signaling pathway and orthodontic tooth movement

LIU Yi,WANG Yan,SUN Su-fen.（Fengtian Dental Clinic,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110013，China）

ObjectiveTo study the relationship between phosphatidylinositol-3-kinases（PI3K）/protein-serine-threonine kinase（AKt）signaling pathway and orthodontic tooth movement.MethodsTwenty-four rabbits were chosen to establish rabbit models for the study.The right maxillary teeth of each animal treated by orthodontics were as the test side, and the untreated left teeth were as the control side.The animals were sacrificed at 3,5,7,14 d,respectively.The prepared tissue specimens were processed for the study.The changes of the expression of PI3K,AKt in periodontal tissues were detected by real-time quantitative-polymerase chain reaction（RQ-PCR）and Western blot techniques.Results RQ-PCR showed that the expression of PI3K,AKtmRNA dramatically changed at 3 d.The expression of PI3K,AKt mRNA in the test side was higher than the control side,especially at 7 d,and then decreased.Compared with the control side,there was statistical significant difference in the test side（P＜0.05）.The study obtained consistent conclusion from Western blot and RQ-PCR.ConclusionExpression of PI3K,AKt in rabbit periodontal tissues increase during orthodontic tooth movement,which prompts that PI3K/AKt signal pathways relate to orthodontic tooth movement and PI3K/AKt signal pathway involve in the periodontal tissue remodeling.

phosphatidylinositol-3-kinases； protein-serine-threonine kinase； real-time quantitative-polymerase chain reaction

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.006

1000－1182（2011）03－0246-03

2010-05-21；

2011-04-05

遼寧省科學技術計劃基金資助項目（2009225010-27）；沈陽市科學技術計劃基金資助項目（1072033-1-00）

劉奕（1964—），女，遼寧人，教授，博士

劉奕，Tel：024-31973999