三維培養模型中胰島素樣生長因子-Ⅰ對人牙周膜細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響

李彥 牛忠英 湯楚華 包博 師天鵬 司少艷

（1.解放軍總醫院 軍醫進修學院，北京 100853；

2.解放軍第306醫院 全軍口腔疾病診治中心；3.病理實驗科，北京 100101）

三維培養模型中胰島素樣生長因子-Ⅰ對人牙周膜細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響

李彥1，2牛忠英2湯楚華2包博2師天鵬2司少艷3

（1.解放軍總醫院 軍醫進修學院，北京 100853；

2.解放軍第306醫院 全軍口腔疾病診治中心；3.病理實驗科，北京 100101）

目的 了解胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）在三維培養條件下對人牙周膜細胞（hPDLCs）增殖及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。方法 通過組織塊法分離培養hPDLCs。采用旋轉細胞培養系統（RCCS）建立三維培養環境。將細胞分為4組，分別為陰性對照組、陽性對照組（三維培養組、IGF-Ⅰ組）、實驗組（三維培養加IGF-Ⅰ組）。各組細胞分別培養1、3、5、7 d。采用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測各組各時間點細胞增殖情況，分光光度計法檢測ALP活性。結果 與陰性對照組相比，三維培養加IGF-Ⅰ組細胞增殖自3 d時顯著增加（P<0.05），且高于三維培養組（P<0.05）。在培養3、5、7 d時，三維培養加IGF-Ⅰ組ALP活性顯著高于陰性對照組（P<0.05）；與三維培養組相比，三維培養加IGF-Ⅰ組ALP活性在3、5、7 d均顯著增高（P<0.05）。結論 IGF-Ⅰ在三維培養條件下仍可顯著促進hPDLCs增殖及其ALP活性。

人牙周膜細胞； 胰島素樣生長因子-Ⅰ； 增殖； 堿性磷酸酶； 三維培養

牙周炎是導致成年人失牙的主要原因，缺損牙周組織的修復催生了牙周組織工程的發展。而體外構建具有生理結構和功能的牙周組織需建立能夠使細胞三維生長的培養環境，細胞三維培養體系應運而生。已有學者成功利用三維培養體系構建了與體內組織形態及功能相似的軟骨組織塊，并在唾液腺上皮細胞、成骨細胞、肝細胞、心肌細胞等多種細胞的三維培養上取得了進展[1-2]。筆者在前期研究中也成功地建立了人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的三維培養模型，并觀察到三維培養環境可促進細胞增殖及成骨向分化[3]。

胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ）是一種重要的調控因子。研究表明：IGF-Ⅰ在牙周膜細胞外基質及血管周圍有表達，并可通過自分泌及旁分泌等方式作用于靶細胞，是調節細胞增殖和分化的關鍵因子。本研究中分離培養了hPDLCs，通過比較各組細胞增殖及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，探討IGF-Ⅰ在三維培養環境中對hPDLCs增殖及成骨向分化的調控作用，并且為進一步研究體外構建牙周組織提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

雙抗PBS液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培養基、谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶、抗壞血酸、甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（Gibco公司，美國），IGF-Ⅰ、ALP檢測試劑盒、Triton X-100、考馬斯亮蘭（Sigma公司，美國），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、青霉素、鏈霉素（Amresco公司，美國），抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體（Dako公司，美國），流式細胞分析儀（Coulter公司，美國），紫外線分光光度儀（Eppendorf公司，德國），55mL旋轉細胞培養體系（rotary cell culture system，RCCS）（Synthecon公司，美國），軟骨細胞微載體（Cytodex-3，GE Healthcare公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養和鑒定 經受試者知情同意后，收集因正畸拔除、牙周組織健康、無齲的新鮮前磨牙或第三磨牙共8顆，經雙抗PBS液及DMEM液反復清洗后刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1mm3的小塊，以5mm間隔將所得組織塊均勻接種于25 cm2培養瓶瓶底，翻轉培養瓶，向內加入4mL DMEM培養基（含10%胎牛血清、100μmol·L-1抗壞血酸、2mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素）。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉培養瓶，3 d后更換培養液，2～3 d換液1次，細胞匯合至培養瓶80%時用胰酶消化傳代，取生長良好的第1代細胞制備細胞爬片，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，檢測細胞來源并于光鏡下觀察。

1.2.2 實驗分組 為研究IGF-Ⅰ在三維培養環境中對hPDLCs增殖及ALP活性的影響，將細胞分為4組，分別為陰性對照組（即常規平皿培養）、陽性對照組（三維培養組和IGF-Ⅰ組）和實驗組（三維培養加IGF-Ⅰ組）。預實驗在三維模型中培養hPDLCs 72 h，經MTT法檢測加入不同濃度IGF-Ⅰ（0.1、1、10、100μg·L-1）的各實驗組細胞增殖活性與對照組（三維培養但無IGF-Ⅰ加入）的差異。分光光度計法檢測各組ALP活性。結果顯示各實驗組增殖活性均顯著高于對照組（P<0.05），0.1μg·L-1組與100μg·L-1組間細胞增殖活性差異有統計學意義（F=26.741，P<0.05）。各實驗組的ALP活性均顯著高于對照組（P<0.05），100μg·L-1組的ALP活性顯著高于其他濃度組（F= 194.362，P<0.05）。根據預實驗結果選擇IGF-Ⅰ實驗濃度為100μg·L-1。

1.2.3 hPDLCs的三維培養 在生物反應器中加入150 mg Cytodex-3及含10%FBS的DMEM培養基，37℃孵育2 h。將hPDLCs單細胞懸液緩慢均勻加入生物反應器中并補充新鮮DMEM培養基至半量容積。反應器重新放入37℃孵箱中孵育。12 h后從孵箱中取出反應器，補充預熱的含10%FBS的α-MEM培養基，排凈氣泡，調整反應器旋轉速度使微載體懸浮于培養液中，再將其放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖 上述各組分別于培養1、3、5、7 d后，將細胞置于六孔板中，加2mL培養基及MTT液（5 g·L-1）20μL混勻，細胞培養箱培養4 h。小心吸棄孔內培養液，每孔加入DMSO 0.2mL，室溫下放置并振蕩20min，充分溶解結晶物并混勻。酶標儀在波長490 nm下測定各孔光密度值（A值）。將每組A值的均值作為實驗結果，代表細胞增殖情況。

1.2.5 分光光度計法檢測ALP活性 檢測時間點同MTT實驗，方法如下：用0.01mol·L-1的PBS洗滌細胞3次，吸干，每孔加入50μL 0.2%的TritonX-100裂解液，37℃裂解30min，倒置顯微鏡下觀察到細胞形態完全消失后，使用ALP檢測試劑盒檢測各組細胞的ALP活性。采用國際臨床化學和實驗室醫學聯盟（IFCC）推薦法測定hPDLCs的ALP活性，考馬斯亮蘭微板法定量測定樣本中蛋白量，計算每毫克凍融蛋白中所含的ALP比活性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行分析，計量資料應用2組獨立樣本t檢驗比較均數差異，單因素方差分析（ANOVA）法分析組間是否存在差別，存在組間差別時采用Tukey法進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞來源鑒定結果

培養細胞的鑒定結果為波形絲蛋白染色陽性（圖1），角蛋白染色陰性（圖2），證實為hPDLCs。

圖1 波形絲蛋白染色陽性 SP ×100Fig 1 Staining of crinkle fibroin was positive SP ×100

圖2 角蛋白染色陰性 SP ×100Fig 2 Staining of keratin was negative SP ×100

2.2 不同培養條件對hPDLCs增殖活性的影響

MTT法檢測不同培養條件下hPDLCs增殖活性的結果見表1。由表1可見，在培養1、3 d時，陰性對照組與三維培養組細胞增殖差異無統計學意義（P＞0.05）；培養5、7 d時，三維培養組細胞增殖顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。培養3、5、7 d時，三維培養加IGF-Ⅰ組細胞增殖均顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。在培養3、5、7 d時，三維培養加IGF-Ⅰ組細胞增殖活性較三維培養組顯著增強（P＜0.05）。三維培養加IGF-Ⅰ組與IGF-Ⅰ組相比，細胞增殖差異無統計學意義。

表1 不同培養條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs細胞增殖的影響Tab 1 The effect of IGF-Ⅰon hPDLCs proliferation in different culture conditions ±s

表1 不同培養條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs細胞增殖的影響Tab 1 The effect of IGF-Ⅰon hPDLCs proliferation in different culture conditions ±s

注：*為與陰性對照組相比，P＜0.05；a為與三維培養組相比，P＜0.05。

時間/d細胞增殖陰性對照組 三維培養組 IGF-Ⅰ組 三維培養加IGF-Ⅰ組1 0.292±0.017 0.314±0.023 0.387±0.032 0.371±0.041 3 0.331±0.051 0.350±0.047 0.490±0.050* 0.507±0.054*a 5 0.376±0.032 0.446±0.019* 0.573±0.061* 0.581±0.056*a 7 0.412±0.030 0.533±0.051* 0.729±0.054* 0.768±0.062*a

2.3 不同培養條件對hPDLCs ALP活性的影響

與陰性對照組相比，三維培養組、IGF-Ⅰ組及三維培養加IGF-Ⅰ組ALP活性在培養3、5、7d時均顯著增強（P＜0.05）。與三維培養組相比，三維培養加IGF-Ⅰ組ALP活性在培養3、5、7 d顯著增強（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同培養條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs ALP活性的影響Fig 3 ALP activity of hPDLCs in different culture conditions

3 討論

hPDLCs是牙周膜的主體細胞，具有多種分化潛能[4]，在維持牙周組織代謝更新的動態平衡中扮演了重要角色。牙周組織工程正是利用hPDLCs的多向分化特性，通過體外培養獲得具有生理結構及功能的牙周組織。

牙周組織工程的關鍵在于構建三維組織形態以及調控細胞分化。RCCS可使細胞隨所附著的載體旋轉并懸浮于培養液中，形成培養細胞的三維環境。有研究表明：RCCS建立的三維細胞培養體系有利于細胞聚集成組織樣結構，并可使細胞間橋連增多[5-6]。這一技術使體外構建三維組織結構成為可能，并已在軟骨細胞、成骨細胞、心肌細胞、唾液腺上皮細胞、卵泡瘤細胞以及肝細胞等多種細胞的三維培養中取得進展[7-12]。

生理狀態下，hPDLCs的各向分化受多種生長因子的共同調控。在體外三維培養條件下，模擬體內環境加入相應生長因子，將有助于誘導hPDLCs的多向分化，從而構建具有生理結構及功能的牙周組織。IGFs廣泛存在于機體組織，其中IGF-Ⅰ在hPDLCs外基質及血管周圍含量較高，并通過旁分泌等方式作用于周圍細胞[13]。研究表明：IGF-Ⅰ在間充質細胞、成骨細胞及軟骨細胞等細胞類型中扮演著重要的調控增殖、分化的角色[14-15]。研究結果顯示，IGF-Ⅰ能夠抑制牙周膜成纖維細胞的DNA裂解，并通過調控抗凋亡及前凋亡分子的表達而呈現出顯著的抗凋亡作用，此外還觀察到IGF-Ⅰ具有促進骨形成、抑制膠原降解以及介導其他生長因子調控等作用。然而上述研究均是在平皿培養環境下得出的，在三維培養模型中IGF-Ⅰ對hPDLCs的作用尚未見報道。

本實驗通過建立三維細胞培養模型，比較IGF-Ⅰ在常規平皿培養與三維培養的不同條件下對hPDLCs增殖及其ALP活性的影響。通過對MTT檢測結果的分析可知，與單純的三維培養相比，加入100μg·L-1的IGF-Ⅰ可進一步促進細胞增殖。說明IGF-Ⅰ在三維培養條件下仍具有顯著的促增殖作用。IGF-Ⅰ受體由四聚體糖蛋白組成，其中2個α亞基位于細胞外部，2個β亞基為跨膜蛋白。上述結果提示三維培養造成的懸浮狀態并未影響IGF-Ⅰ受體與IGF-Ⅰ的結合。

ALP作為一種膜結合蛋白，是牙周膜細胞中成骨細胞亞群的標志性蛋白[16]，其活性可以反映牙周組織改建的活躍程度，ALP活性檢測也是評價hPDLCs功能的重要指標。本研究結果顯示，無論是常規培養條件還是三維培養條件，加入IGF-Ⅰ后ALP的活性都表現為顯著增強的趨勢，提示IGF-Ⅰ在常規培養和三維培養條件下均可以促進hPDLCs的成骨向分化。

綜合分析上述實驗結果可知，三維培養加IGF-Ⅰ組在細胞增殖及ALP活性兩方面都顯著高于陰性對照組及陽性對照中的三維培養組，說明IGF-Ⅰ在三維培養下對hPDLCs具有促增殖和提高ALP活性的作用，并且IGF-Ⅰ與三維培養系統具有協同作用。但三維培養加IGF-Ⅰ組的細胞增殖及ALP活性與陽性對照中的IGF-Ⅰ組并無顯著差異（僅在5 d時ALP活性高于IGF-Ⅰ組），這一結果提示IGF-Ⅰ與三維培養系統間的協同作用并非簡單的相加關系，具體機制尚待深入研究。陽性對照的三維培養組在細胞增殖及ALP活性等方面均顯著高于陰性對照組，這一結果與之前研究結果一致，表明三維培養對細胞增殖及成骨向分化具有一定的促進作用。

本研究結果提示，通過RCCS構建的三維培養模型可用于體外培養hPDLCs，且IGF-Ⅰ在此培養體系可顯著促進細胞增殖及成骨向分化。但成功構建具有生理結構及功能的牙周組織需多種生長因子的共同調控，掌握其作用規律尚待深入研究。

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（本文編輯 胡興戎）

The effect of insulin-like grow th factor-I on the proliferation and alkaline phosphatase activity of human periodontal ligament cells under three-dimensional culture system

LI Yan1，2,NIU Zhong-ying2,TANG Chu-hua2,BAO Bo2,SHI Tian-peng2,SI Shao-yan3.（1.Military Postgraduate Medical College,General Hospital of PLA,Beijing100853,China;2.Oral Disease Treatment Center of PLA,306Hospital of PLA,Beijing100101,China;3.Dept.of Pathology and Laboratory,306Hospital of PLA,Beijing100101,China）

ObjectiveTo investigate the effect of insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）on the proliferation and alkaline phosphatase（ALP）activity of human periodontal ligament cells（hPDLCs）under three-dimensional（3D）culture system.MethodsThe hPDLCs were cultured from periodontium of human teeth by the outgrowth method.Rotary cell culture system（RCCS）was enrolled to set 3D culture system.Samples were set to four groups:Negative control group,positive control group（3D group,IGF-Ⅰgroup）,and experimental group（3D with IGF-Ⅰgroup）.Proliferation was tested with methylthiazolyl tetrazolium（MTT）,and ALP activity was assayed by spectrophotometer at 1,3,5,7 d respectively.Results Compared with that of negative control group,cell proliferation increased significantly in 3D with IGF-Ⅰgroup since 3 d（P<0.05）.Besides,the cell proliferation of 3D with IGF-Ⅰgroup was significantly higher than that of 3D group（P<0.05）.ALP activity of 3D with IGF-Ⅰgroup was significantly higher than that of negative control group，and 3D group at 3,5,7 d（P<0.05）.ConclusionIGF-Ⅰsignificantly promotes the proliferation and ALP activity of hPDLCs under 3D culture system.

human periodontal ligament cells； insulin-like growth factor-Ⅰ； proliferation； alkaline phosphatase；three-dimensional culture

R 780.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.002

1000－1182（2011）03－0229-04

2010-12-28；

2011-04-05

國家自然科學基金資助項目（30870598）

李彥（1979—），女，天津人，主治醫師，碩士

牛忠英，Tel：010-66355041