肽段連接的近紅外熒光量子點對人頰鱗癌BcaCD885細胞侵襲和轉移能力的影響

梅杰 楊凱 李志剛 曹雨庵

（重慶醫科大學附屬第一醫院 口腔頜面外科，重慶 400016）

肽段連接的近紅外熒光量子點對人頰鱗癌BcaCD885細胞侵襲和轉移能力的影響

梅杰 楊凱 李志剛 曹雨庵

（重慶醫科大學附屬第一醫院 口腔頜面外科，重慶 400016）

目的 研究肽段連接的近紅外熒光量子點（QDs）對人頰鱗癌BcaCD885細胞的生長、侵襲、黏附和趨化運動能力的影響。方法 1）用表面連接穿膜肽段最大發射波長為800 nm的近紅外熒光量子點（QD800）標記BcaCD885細胞（BcaCD885/QD800），用流式細胞儀檢測QD800對BcaCD885細胞的標記率，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察QD800在BcaCD885細胞內的分布情況；2）用不同濃度的QD800與BcaCD885細胞共培養，觀察QD800對BcaCD885細胞生長的影響；3）用Transwell侵襲小室法和沖刷實驗，比較BcaCD885/QD800和BcaCD885細胞侵襲、黏附和趨化運動能力的變化。結果 1）QD800對BcaCD885細胞標記后6 h時的標記率為94.07%，QD800主要分布在細胞質內；2）不同濃度的QD800均未影響BcaCD885細胞的生長情況；3）BcaCD885/QD800和BcaCD885細胞的侵襲、黏附和趨化運動能力無顯著性差異（P＞0.05）。結論 用肽段連接的近紅外熒光量子點標記BcaCD885細胞后不影響其生長、浸潤和轉移能力，為利用量子點進一步在活體條件下非侵入的體內腫瘤細胞成像和示蹤研究提供了科學依據。

量子點； 近紅外熒光； 黏附； 侵襲

發展對體內癌細胞非侵入可視化的監測方法對研究腫瘤的發生發展、早期診斷及治療具有重大意義。由于新型納米熒光探針量子點（quantum dots， QDs）與目前已有的有機熒光染料探針和熒光蛋白相比具有光穩定性好、熒光量子產率高等優良的光學特征，在對體內癌細胞非侵入長期示蹤觀察方面具有很大的發展前景[1]，特別是發射波長在近紅外光范圍內（700～900 nm）的量子點的熒光不僅對人體組織具有強的穿透力，同時也可避免組織自發熒光（400～600 nm）的干擾，特別適合行體內非侵入的醫學成像。近年來證明：用具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs能提高對細胞的標記率[2]。雖然目前研究已表明生物化的QDs標記癌細胞后對細胞沒有毒性，并且不影響其生長及分化[1，3]，但具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs大量標記進入癌細胞后是否影響其生長、浸潤和轉移等生物學行為這些關鍵問題目前還未見報道，這是用QDs標記癌細胞后進行非侵入可視化研究得到的結論是否科學的首要關鍵問題。本研究利用表面連有肽段，最大發射波長為800 nm的近紅外熒光量子點QD800通過內吞作用標記人頰鱗癌BcaCD885細胞，觀察被QD800標記后BcaCD885的生長、侵襲、黏附和趨化運動能力的改變情況。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人頰鱗狀細胞癌細胞株BcaCD885細胞（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室），QtrackerTM800 Cell Labeling Kit（Invitrogen公司，美國），Tcs-sp5激光掃描共聚焦顯微鏡（laser-scanning confocal microscope，LSCM）（Leica公司，德國），流式細胞儀（BD公司，美國），Z233MK-2冷凍低速離心機（Hermle公司，德國），Transwell侵襲小室（Costar公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 QDs對BcaCD885細胞的標記 QD800標記BcaCD885細胞根據QtrackerTM800 Cell Labeling Kit提供的實驗步驟進行，簡述如下：制備10 nmol·L-1的QD800標記液待用，將用胰蛋白酶消化后的Bca-CD885細胞移入EP管內，共1×106個細胞，然后加入0.2mL QD800標記液，吹打均勻后，置培養箱中共同培養1 h后冷凍低速離心5 min（1 000 r·min-1，4℃），棄去培養液，PBS沖洗細胞2次，洗掉未進入細胞內的QD800，然后再加入培養基繼續培養6 h后，將QD800標記的細胞（BcaCD885/QD800）消化吹打成懸液，用流式細胞儀檢測標記率。用LSCM觀察QD800標記BcaCD885細胞后QD800在細胞內的分布情況。實驗重復3次，取平均值計算標記率。

1.2.2 QDs對BcaCD885細胞生長的影響 將生長旺盛的BcaCD885細胞按每毫升2×104個的密度接種到4塊24孔培養板內，每孔0.18mL，分為4組，培養24 h使細胞生長相對同步化后，對照組加入含15%小牛血清的PRMI1640培養液0.02mL，實驗組分為A、B、C組，分別加入0.02mL不同濃度的QD800，使實驗組A、B、C組所加入QD800后的終濃度分別為5、10、15 nmol·L-1，每天各組隨機取3孔用0.1%胰酶充分消化，吹打細胞培養液，制成單細胞懸液，用血球計數板計算細胞，計算平均值，連續8 d，繪制細胞的生長曲線。實驗重復3次，取其平均值。

1.2.3 QDs對BcaCD885細胞黏附力影響分析 按前面1.2.1實驗方法分別制備密度為每毫升5×106個的BcaCD885/QD800和Tca8113細胞2組懸液，取24孔細胞培養板,每孔加細胞懸液0.2mL，每組12孔，分別于培養30、60、90、120min后各組隨機取3孔棄去培養液，PBS液輕洗2遍，去除未真正黏附而貼附于孔底的細胞，0.25%胰酶消化后顯微鏡下計數，用下式計算不同時間的細胞黏附率：細胞黏附率=黏附細胞數/總細胞數×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 QDs對BcaCD885細胞侵襲力影響測定 按前面1.2.1實驗方法將QD800與BcaCD885細胞共同培養，QD800濃度為10 nmol·L-1，培養1 h后，用0.1%胰酶充分消化后離心得到被QD800標記的BcaCD885細胞（即BcaCD885/QD800）。細胞侵襲重建基底膜實驗在Transwell小室中進行，Transwell小室被孔徑為8μm的聚碳酸多孔濾膜分為上下兩室，在濾膜上下分別鋪以15μg Matrigel，于37℃下重建1 h后備用。將BcaCD885/QD800和BcaCD885以2×105個細胞加入Transwell小室的上室中，37℃培養12 h，侵襲至濾膜下表面的細胞用蘇木精-伊紅染色后，隨機選擇5個400倍顯微視野，重復3次，以平均數作為穿膜細胞數來表示BcaCD885細胞的侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 QDs對BcaCD885細胞趨化運動影響分析 該實驗與前面1.2.4實驗的差異在于聚碳酸多孔濾膜表面未鋪Matrigel，其余步驟和方法相同，仍隨機選擇5個400倍顯微視野統計濾膜下表面的細胞數目，以細胞的相對數目來表示BcaCD885細胞的趨化運動能力。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 QDs對BcaCD885細胞的標記

QD800對BcaCD885細胞標記后6 h用流式細胞儀檢測細胞的標記率為94.07%（圖1），平均熒光強度為234.52。標記6 h后在LSCM下見BcaCD885細胞內有大量的QD800，主要分布在細胞質內（圖2）。

2.2 QDs對BcaCD885細胞生長的影響

用不同時間各組細胞數繪制對照組和各實驗組的生長曲線（圖3），各實驗組和對照組生長曲線無顯著性差異。結果表明本實驗中不同濃度的QD800未影響BcaCD885細胞的生長。

圖1 流式細胞儀檢測QD800標記BcaCD885細胞6 h后的標記率Fig 1 Flow cytometry detection of QD800 labeling of BcaCD885 cells at 6 h

圖2 QD800進入BcaCD885細胞后分布在細胞質內 LSCM ×400Fig 2 QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm LSCM ×400

圖3 對照組和各實驗組的生長曲線Fig 3 Growth curve of control group and each experimental group

2.3 QDs對BcaCD885細胞黏附性的影響

不同時間點BcaCD885/QD800和BcaCD885細胞的黏附率見表1，結果表明：經QD800標記后的Bca-CD885細胞其黏附能力未發生改變。

2.4 QDs對BcaCD885細胞侵襲能力的影響

鋪在多孔濾膜表面上的Matrigel形成類似天然基底膜的結構，細胞穿過Matrigel的能力反映了該細胞的侵襲能力。實驗發現：BcaCD885/QD800和Bca-CD885穿膜細胞均數分別為71.6±2.8、72.8±2.7，兩均數間無顯著差異（P＞0.05），表明經QD800標記后的BcaCD885細胞未影響其侵襲能力。

表1 各時間點BcaCD885/QD800和BcaCD885細胞的黏附率Tab 1 Adhesion of BcaCD885/QD800 and Bca-CD885 cells at 30,60,90 and 120m in

2.5 QDs對BcaCD885細胞趨化運動的影響

BcaCD885/QD800和BcaCD885侵襲至濾膜下表面的細胞數目分別為79.6±4.1、82.3±3.4，兩均數間無顯著差異（P＞0.05），表明經QD800標記后的Bca-CD885細胞未影響其趨化運動能力。

3 討論

近年來基于多學科交叉發展起來的量子點納米熒光探針，與目前已有的有機物熒光探針（如rhodamine、FITC、Cy3、Cy5等）和各種熒光蛋白探針相比，它具有熒光量子產率高、發光度強、光化學穩定性好、不易被光解或漂白[4-5]，同時QDs的發光特征具有嚴格的量子尺寸效應,通過改變QDs粒徑大小可獲得從紫外到近紅外范圍（或從藍色到紅色波長范圍）內任意點的光譜[6]，QDs的這些光學特征是目前所有的熒光探針都不具備的，如果用QDs標記活細胞就可以利用這些光學特征長期觀察或同時觀察多種活細胞的相互作用及變化情況[1]。

QDs優良的光學特征已在活體非侵入原位研究癌細胞在體內的發生發展、癌癥的早期診斷、藥物在體內的轉運過程等領域顯示出了巨大的發展前景[7-8]，特別是近年來發展起來發射波長在近紅外光范圍內的量子點的熒光不僅對人體組織具有強的穿透力，同時也可避免組織自發熒光的干擾，特別適合行體內非侵入的細胞成像。目前人們利用近紅外熒光量子點對體內腫瘤細胞侵襲和轉移情況進行成像研究[2，9]證明：QD800不僅具有良好的體內成像能力，而且對細胞沒有毒性和不影響其生長。近年來證明用多種具有穿膜作用的肽段表面修飾的QDs能提高對細胞的標記率[10-12]。但還未查見具有穿膜作用的肽段表面修飾的量子點大量標記進入癌細胞后對腫瘤細胞侵襲和轉移能力有無影響的研究報道，這是用QDs標記癌細胞后進行非侵入可視化研究得到的結論是否科學以及是否真實地反映了體內癌細胞浸潤、轉移的情況的首要關鍵問題之一。

本研究用最大發射波長為800 nm的近紅外熒光量子點，由于該量子點表面連接有富含精氨酸聚合體的肽段，因而具有較強的穿膜作用。本研究用肽段連接的QD800與BcaCD885細胞共培養證明：QD800能快速容易進入細胞內對細胞進行標記，標記6 h后對BcaCD885細胞的標記率高達94.07%，大量肽段連接的QD800進入BcaCD885細胞后對細胞的生長、侵襲、黏附和趨化運動能力均無影響。

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（本文編輯 湯亞玲）

Study on effect of peptide-conjugated near-infrared fluorescent quantum dots on invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line BcaCD885

MEI Jie,YANG Kai,LI Zhi-gang,CAO Yu-an.（Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China）

ObjectiveTo study the effect of peptide-conjugated near-infrared quantum dots（QDs）on growth, invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line（BcaCD885 cell）.Methods1）BcaCD885 cells were labeled by cell-penetrating peptide-conjugated QDs with a maximum emission wavelength of 800 nm（QD800）,then labeling efficiency was detected by flow cytometry,and laser-scanning confocal microscope was used to observe the distribution of QD800 within the cells.2）Different concentrations of QD800 was applied to BcaCD885 cells,and the cell growth of control and three test groups were compared respectively.3）BcaCD885 cells were labeled by QD800（BcaCD885/QD800）,then transwell chambers and wash way were used to dectect the difference of invasion and metastasis ability between BcaCD885/QD800 and BcaCD885 cells.Results 1）The labeling rate of BcaCD885 cells after 6 h was 94.07%,and QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm.2）Different concentrations of QD800 showed no negative effects on growth of BcaCD885 cells.3）The ability of invasion,attachment and motion of BcaCD885 cells were not significantly different between test and control group（P＞0.05）.ConclusionQDs showed no effects on growth,invasion and metastasis ability of BcaCD885 cells.Our results provide science foundation for QDs as a new fluorescence probes to real-time monitor cells and cells imaging in a living.

quantum dots； near-infrared fluorescence； attachment； invasion

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.022

1000－1182（2011）01－0092-04

2010-09-25；

2010-12-20

國家自然科學基金資助項目（30872925和30470893）

梅杰（1982—），男，重慶人，碩士

楊凱，Tel：023-89012569