鈦片表面粗糙度和氧化膜對成骨細胞黏附影響的體外研究

周屹立 丁仲鵑 唐玲

（1.昆明醫學院口腔醫學院 口腔修復學教研室，昆明 650031；2.昆明市第一人民醫院 口腔修復科，昆明 650032）

鈦片表面粗糙度和氧化膜對成骨細胞黏附影響的體外研究

周屹立1丁仲鵑1唐玲2

（1.昆明醫學院口腔醫學院 口腔修復學教研室，昆明 650031；2.昆明市第一人民醫院 口腔修復科，昆明 650032）

目的 研究鈦片表面粗糙度和氧化膜對成骨細胞黏附的影響，為選擇臨床種植體的表面處理方法提供依據。方法 250片純鈦鈦片分為5組。采用直徑分別為108～130μm（S1組）、216～301μm（S2組）、356～411μm（S3組）TiO2砂對鈦片表面進行噴砂處理；另外一組鈦片采用鈦漿噴涂（TPS）技術處理，設為TPS組；最后一組以600目SiC砂紙打磨組作對照（S0組）。分別測定鈦片表面的粗糙度和氧化膜結構。在5組鈦片表面進行成骨細胞培養，比較各組鈦片表面成骨細胞在黏附1、4、12及24 h時的形態及黏附率。結果 S3組鈦片表面氧化膜結構完整、連續，其表面的成骨細胞形態優于其他組。黏附1、4 h時，S3組黏附率高于其他各組（P＜0.05）；黏附12、24 h時，S3和TPS組黏附率高于其他各組（P＜0.05）；黏附4、12、24 h時，S1、S2、S3和TPS組黏附率均高于S0組（P＜0.05）。結論 表面粗糙度較高的噴砂表面的粗糙度和氧化膜結構更有利于成骨細胞黏附。

成骨細胞； 粗糙度； 二氧化鈦膜； 黏附

細胞黏附于種植材料表面是細胞表面受體與材料表面的相應配體之間產生分子識別后進一步特異性相互作用的過程。鈦種植體的表面性質，包括化學組成、粗糙度、表面能及氧化膜厚度，對種植體與生物體間的反應起重要作用[1-3]。種植材料的表面結構可以選擇所吸附蛋白的種類、活性和結構穿膜受體蛋白可以調節細胞與材料表面的黏附，它與細胞骨架結構相聯系，其中灶性接觸發揮了重要作用。灶性接觸成分由一些與細胞骨架和細胞外基質相關的大分子構成，它將整合素受體與細胞骨架肌動蛋白聯系起來，影響細胞的伸展、形狀及行為[4-6]?？梢姺N植材料表面粗糙度和表面成分的變化對細胞形態及早期黏附行為有重要影響[7]。

本研究采用不同粒度TiO2對純鈦片表面進行噴砂處理，獲得3種平均粗糙度分別為1.260、2.313、 3.530μm的表面；臨床使用效果較為理想的鈦漿噴涂（titanium-sprayed plasma，TPS）表面的平均粗糙度可達5.239μm。本實驗將經過上述2種處理的表面進行比較，以探索有利于成骨細胞早期伸展和黏附的適宜的表面粗糙度和處理方法。

1 材料和方法

1.1 鈦片表面處理及分析

1.1.1 鈦片表面處理 本實驗所用鈦片均為直徑15mm、厚度1mm，共250片。鈦片采用丙酮脫脂，用質量分數2%氟化胺、質量分數2%氫氟酸和體積分數10%硝酸于55℃處理表面30 s，質量分數2%氫氟酸和體積分數10%硝酸室溫下各處理30 s，去離子水清洗。根據不同的表面打磨方法將鈦片分成5組，每組50片。1）砂紙打磨組（S0組）：依次以240、320、600目SiC防水砂紙同方向逐級打磨，至表面呈金屬光澤、劃痕均勻一致為止。2）噴砂組：分別以直徑108～130μm（S1組）、216～301μm（S2組）、356～411μm（S3組）TiO2砂在壓力為6.5 kPa、距離為10 cm的條件下垂直對已經砂紙打磨的鈦片表面進行噴砂處理，至表面呈均勻的灰色。噴砂儀為JG-5832型，由天津市精工醫療設備技術有限公司生產。3）TPS組：鈦片表面與臨床常用ITI鈦漿噴涂種植體表面相同，由美國Strauman公司提供。S0、S1、S2和S3組鈦片表面處理后，用體積分數10%鹽酸處理1min，去離子水清洗，體積分數30%硝酸鈍化30min后以質量分數5%碳酸氫鈉中和，體積分數75%乙醇超聲清洗10min，去離子水清洗5min，共2遍。最后去離子水超聲清洗10min，共2遍。5組鈦片經處理后，均進行高溫高壓消毒，備用。

1.1.2 表面形貌觀察 隨機抽取5組鈦片中各3片，以掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（XL30ESEM型，Philips公司，荷蘭）在20 kV、放大1 000倍情況下觀察各組鈦片的表面形貌。

1.1.3 表面粗糙度測量 取經過表面形貌觀察的3片鈦片，用表面輪廓測量儀（Surfcom-130A型，Seimitsu公司，日本）測量其表面粗糙度。

1.1.4 表面氧化膜檢測 隨機抽取5組鈦片中的各3片，丙烯酸樹脂垂直包埋，打磨、拋光，使磨光面暴露出鈦片橫斷面，且鈦片垂直于磨光面。表面噴碳，用電子探針分析儀（EPMA-1600型，Shimadzu公司，日本）隨機選點，觀察并分析氧化膜的厚度和結構。

1.2 成骨細胞的體外培養

取臨產SD孕鼠1只（昆明醫學院動物科提供），取胎鼠顱頂骨進行常規成骨細胞的培養。

1.3 鈦片表面成骨細胞形態學觀察

將培養至第4代的成骨細胞，調整為細胞密度為每毫升4×104個的細胞懸液，分別取500μL接種于放有5組鈦片的24孔培養板內，每樣本設3復孔，分別培養1、4、12、24 h，共60個孔。分別于培養后1、4、12、24 h吸去培養液，加入4℃預冷的質量分數2.5%戊二醛溶液固定，4℃保存。觀察時先用梯度乙醇脫水，真空干燥后鍍金，然后將鈦片中心置于SEM視野的中央，再向固定方向移動視野，觀察成骨細胞在不同鈦片表面的黏附形態。每個鈦片在放大5 000倍的情況下拍攝不同位置的成骨細胞照片2張，每個時間點30張，共120張。隨機抽取各時間點的每組鈦片成骨細胞照片1張進行分析。

1.4 鈦片表面成骨細胞黏附率測定

采用MTT法對不同鈦片表面的成骨細胞黏附率進行檢測。按上述方法取500μL細胞懸液分別接種于放有5組鈦片的24孔培養板內，每樣本設8復孔，分別培養1、4、12、24 h，共160個孔。分別于培養后1、4、12、24 h吸去培養液并用PBS洗3次，去除未貼壁細胞，然后加入無血清的DMEM 500μL及5mg·mL-1MTT 50μL，37℃孵箱孵育4 h，加三聯液（質量分數10%十二烷基硫代硫酸鈉25 g、5%異丁醇12.5mL、0.012mol·L-1鹽酸0.3mL，加三蒸水補足250mL）500μL，37℃孵箱內孵育12 h，使結晶物充分溶解。吸取各孔液體200μL至96孔培養板，在酶標板自動讀數儀（BL340型，Biotech公司，美國）上以570 nm波長測定各孔吸光度值（A值）。

1.5 統計學分析

選用SPSS 12.0統計軟件包進行分析，統計方法采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 鈦片表面處理

2.1.1 肉眼觀察 砂紙打磨組（S0組）表面呈銀白色金屬光澤，表面劃痕均勻一致；噴砂組（S1、S2和S3組）表面呈深灰色，無金屬光澤，表面粗糙程度隨噴砂粒度增加而增大；TPS組表面呈淺灰色，粗糙程度最大。

2.1.2 SEM觀察 S0組表面可見方向一致的劃痕，偶見裂隙和點狀凹陷；噴砂組表面呈不規則的多級孔洞，呈蜂窩狀，邊緣銳利，表面顏色形態均勻一致；S2、S3、TPS組表面存在大量微平面；TPS組表面呈不規則的孔洞結構，表面顆粒有互相融合的趨勢，表面顏色形態均勻一致。

2.1.3 表面粗糙度 5組鈦片的表面平均粗糙度檢測結果分別為：S0組為（0.372±0.131）μm，S1組為（1.260±0.063）μm，S2組為（2.313±0.188）μm，S3組為（3.530±0.305）μm，TPS組為（5.239±0.530）μm。

2.1.4 表面氧化膜 S0組表面氧化膜較薄，厚度為0～7μm，密度較低且不連續；S1組表面氧化膜呈鋸齒狀，不連續，最厚處約7μm；S2組表面氧化膜呈鋸齒狀，不連續，最厚處約14μm，密度高于S1組；S3組表面氧化膜密度最高，均勻連續，厚度7～10μm；TPS組表面氧化膜密度最低，不均勻，偽孔處氧化程度較高。

2.2 鈦片表面成骨細胞黏附的形態學觀察

接種于5組鈦片表面1 h后，成骨細胞均呈圓形，邊緣光滑，形態單一，其中S2、S3組表面成骨細胞的體積較大，其余各組細胞的大小和形態均相似（圖1A、B）。接種4 h后，成骨細胞初步伸展；S2、 S3組表面成骨細胞的片足和絲足結構出現，S1組細胞剛剛伸展，尚無此結構；S2、S3組細胞的細胞漿比較豐富；S0組細胞伸展較好，已有定向生長的趨勢；TPS組細胞漿豐富，細胞伸展較好（圖1C、D）。成骨細胞接種12 h后，各組細胞均充分伸展，S1、S2、S3及TPS組表面成骨細胞呈扁平狀，細胞漿豐富（圖1E、F）；S0組細胞呈梭形，細胞拉長，細胞長軸與表面溝紋方向一致。接種24 h后，S1、S2、S3及TPS組表面成骨細胞完全伸展，細胞呈扁平狀，形態各異（圖1G、H）；S2、S3組成骨細胞的片足結構伸入鈦片表面孔洞，與鈦片表面緊密結合；TPS組表面成骨細胞伸展較好；S0組細胞呈梭形，細胞體狹長，伸展較好，細胞沿著表面溝紋方向生長，細胞漿較少。

2.3 鈦片表面成骨細胞黏附率

不同培養時間的各組鈦片表面的成骨細胞黏附率（A值）見表1。培養1 h后，S3組的A值高于其他各組（P＜0.05），其他各組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養4 h后，S3組的A值高于其他各組（P＜0.05），S1和S2組的差異無統計學意義（P＞0.05）；培養12 h后，S3和TPS組的A值的差異無統計學意義，但均高于其他各組（P＜0.05），S1和S2組的差異無統計學意義（P＞0.05）；培養24 h后，S3和TPS組的A值的差異無統計學意義，但均高于其他各組（P＜0.05），S2組的A值高于S1組（P＜0.05）。培養4、12、24 h后，各實驗組的A值均高于S0組（P＜0.05）。

表1 5組鈦片表面成骨細胞的黏附率Tab 1 Adhesion rate of osteoblasts on five surfaces

3 討論

Velten等[8]對熱處理、陽極氧化法和溶膠-凝膠法制備生成的氧化膜分別進行研究，結果表明：3種處理方法的表面抗腐蝕性都高于未處理表面，而且當氧化膜厚度達100 nm時，三者的抗腐蝕性和離子滲出率等性能無明顯差別。也有實驗[9]證實：生物材料與組織相互作用的深度只有1 nm，可以認為種植體表面最外層納米級范圍的表面特性對其生物學行為的影響最為顯著。種植體表面處理技術一方面可通過增加粗糙度來增大表面與成骨細胞的接觸面積；另一方面可通過調節表面與生物大分子的吸附能力來促進細胞的黏附[10]。本研究表明：噴砂組表面隨噴砂顆粒直徑的增加，表面粗糙度也增加，氧化膜結構也越均勻致密，越利于細胞早期黏附。在本實驗中，各噴砂組表面氧化膜厚度遠遠高于納米級，可見影響噴砂組鈦片成骨細胞生物學行為的主要因素是平均粗糙度。S0組和TPS組鈦片未形成明顯的氧化膜或氧化膜不連續，研究S0組和TPS組對成骨細胞生物學行為的作用時，應該考慮其表面化學成分與噴砂組不同這個因素。

成骨細胞接種1 h，各組鈦片表面的成骨細胞尚未伸展，不同的表面處理尚不足以引起細胞形態發生顯著變化。粗糙度較高的噴砂表面成骨細胞體積較大，提示細胞代謝更旺盛，這種表面更利于成骨細胞早期黏附。隨黏附時間延長，各組成骨細胞顯示出一些生長早期的特征，也提示粗糙度較高的噴砂表面更有利于成骨細胞早期黏附。成骨細胞在TPS組鈦片表面伸展也較好，但細胞體與鈦片表面結合不如粗糙度較高的噴砂表面緊密，也少見片足結構伸入鈦片表面孔洞內，證實噴砂處理表面更利于成骨細胞與其結合。Mustafa等[11]的研究也表明：成骨細胞在光滑表面或非常粗糙的表面黏附和伸展較好，因為表面粗糙度達到一定程度后，會形成一些微小的光滑平面，利于細胞黏附和伸展。本研究經SEM觀察，結果顯示：S2、S3和TPS組表面有大量微小平面存在。由此可見：光滑表面和較高粗糙度的表面均有利于細胞伸展，但是光滑表面和TPS表面的成骨細胞胞體扁平，細胞漿不如噴砂表面的細胞漿豐富，細胞功能可能不如噴砂組表面的成骨細胞。表面粗糙度較低或氧化膜缺陷，是成骨細胞生物學行為不如S3組噴砂表面的重要因素。

本研究結果表明：培養1 h后，成骨細胞在S0、S1、S2、TPS表面黏附率的差異無統計學意義。Rosa等[12]認為：以上這幾種粗糙表面對生物大分子的吸附作用還不足以在短時間內對細胞黏附率產生明顯影響。Mustafa等[13-14]發現：表面粗糙度的增加不能影響成骨細胞在鈦片表面的早期黏附。上述實驗[13-14]所獲得的表面粗糙度均不超過2μm。本實驗結果顯示：粗糙度較低的2組噴砂表面的細胞黏附率較低，該結果支持上述結論。經過1、4、12、24 h培養后，S3組的細胞黏附率最高，此現象表明：噴砂處理表面的粗糙度增加到一定程度時，其表面形態和氧化膜結構更利于成骨細胞黏附。S3組表面細胞黏附率高于TPS組，除了噴砂表面形態更利于細胞黏附外，其氧化物厚度和結構均優于TPS表面也是重要原因。

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（本文編輯 胡興戎）

Effect of surface roughness and titanium dioxide layers on commercially pure titanium on attachment of osteoblasts

ZHOU Yi-li1,DING Zhong-juan1,TANG Ling2.（1.Dept.of Prosthodontics,College of Stomatology, Kunming Medical University,Kunming650031,China;2.Dept.of Prosthodontics,The First People’s Hospital of Kunming,Kunming650032,China）

ObjectiveTo study the effects of surface roughness and titanium dioxide（TiO2）layers on commercially pure titanium（cp-Ti）substrates on attachment of osteoblastsin vitro.Methods250 pure titanium slices were divided into five groups.Osteoblasts were cultured on five cp-Ti substrates of ground,which blasted with 108-130μm（S1）, 216-301μm（S2）,356-411μm（S3）TiO2particles and titanium-sprayed plasma（TPS）surfaces,surfaces prepared by hand grinding with SiC paper to 600 grits served as control（S0）.Surface average roughness and the TiO2film structure was evaluated.For morphology and attachment measurement,osteoblasts were cultured for 1,4,12 and 24 h, evaluated by scanning electronic microscope（SEM）observation and MTT assay.Results Osteoblasts spread well on the titanium surfaces.Further more,osteoblasts spread more well on S3surfaces.After 1 and 4 h culture,the number of cells on S3surfaces was the highest（P＜0.05）.The number of cells on S3surfaces was the same（P＞0.05）as TPS surfaces and higher than other groups（P＜0.05）after 12 and 24 h.The number of cells of all experimental groups were higher than S0surfaces after 4,12 and 24 h（P＜0.05）.ConclusionIt was concluded that the coarse TiO2particles blasted surface would optimize initial osteoblast responses.

osteoblast； roughness； titanium dioxide layer； attachment

R 783.1

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.004

1000－1182（2011）01－0013-04

2009-12-31；

2010-06-24

周屹立（1972—），男，浙江人，主治醫師，碩士

丁仲鵑，Tel：0871-5330099