SPR生物傳感器連續取樣和檢測裝置研制

初國超，鄭先哲，張文浩，丁凝冶，劉成海

（東北農業大學工程學院，哈爾濱 150030）

食品加工過程中的微生物含量檢測是保證食品安全，控制食品質量的重要環節。現階段，我國的主要儀器檢測是在食品生產完成后，在實驗室內進行，如出現質量問題，則此批產品就無法再利用，檢測結果嚴重滯后于生產，一旦出現問題，將會造成極大的浪費。產品生產過程的控制難度較大，同一產品不同批次的品質、風味差異較大，難以實現標準化[1]。對于發酵食品來說，發酵液中常存在對酶干擾的物質[2]。并且多數不是清澈透明的,常規的光譜方法不適于測定發酵液中的物質，但生物傳感器對這些情況有較好的適應性，并且應用很廣泛。Rasooly使用SPR生物傳感器快速檢測出了食物中葡萄球菌腸毒素B（SEB）的濃度[3]。Naimushin等運用微型集成式雙通道SPR傳感器能直接檢測低于納摩爾水平的SEB蛋白毒素[4]。Van等利用SPR技術檢測食品中毒枝菌素的含量[5]。Gertie等利用SPR生物傳感器檢測沙門氏菌B、D、E，此法成功的在1×107cfu·mL-1樣品中檢出沙門氏菌53個[6]。向四海等研究了使用表面等離子體諧振SPR-2000生化分析儀檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）與羊單克隆抗體IgG的免疫吸附反應[7]。葛晶等根據大腸桿菌抗體的免疫吸附反應，使用SPR生物傳感器快速檢測大腸桿菌E.coli O157∶H7，采用親和素-生物素系統放大檢測的響應信號，并引入復合抗體作為二次抗體，使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106cfu·mL-1下降到105cfu·mL-1[8]。

表面等離子共振生物傳感器（Surface plasmon resonance，SPR）依據表面等離子共振原理，將已知的生物分子固定在50nm的Au膜表面,加入與其互補的目標生物分子，在應用SPR生物傳感器的過程中，兩者結合（雜交）將使Au膜與溶液界面的反射光強度變化，折射率上升，從而導致共振角改變，根據共振角的改變程度，由光電探測器檢測這種連續變化，進而分析被測物的濃度[9-14]。與傳統的檢測技術如超速離心、熒光法、熱量測定法等相比，SPR生物傳感器具有如下顯著特點:①樣品需要量極少，一般一個表面僅需約1μg蛋白配體；②檢測過程方便快捷，靈敏度高；③大多數情況下，不需對樣品進行預處理；④由于SPR是基于對未穿透樣品的反射光的測量，所以檢測能在混濁的甚至不透明的樣品中進行。

由于生物傳感器具有這些優點，適用于對發酵液進行細菌檢測。但目前國內外研制的SPR監測分析系統基本上都是大型專業化儀器，存在結構復雜、體積龐大、成本高、不能用于現場在線監測等缺點，大多局限于實驗室內使用，并且各大公司研究的主流方向是開發通用型的高精尖實驗室儀器，針對對象主要是科研單位和大型制藥公司等，不能滿足發酵食品在線檢測的要求[15]。因此，研究一種小型SPR檢測儀器，使之能夠滿足高靈敏、現場在線和低成本的檢測要求，既符合市場需求，也具有十分重要的社會和經濟意義。

1 生物傳感器連續取樣和檢測裝置設計思路

由于SPR生物傳感器的高靈敏性對實驗人員的操作要求很高，人工操作時的抖動、每次檢測時傳感器固定位置的不確定等都不可避免的對檢測結果造成影響；并且操作人員直接接觸含有細菌的樣品會造成自身安全隱患，并且易污染樣品。所以，針對實際檢測時存在上述的問題，結合SPR生物傳感器檢測樣品時的工藝要求，對取樣檢測裝置進行設計。具體流程見圖1。

圖1 SPR生物傳感器檢測微生物的流程Fig.1 Flow of microbial detection by SPR Biosensor

設計的裝置與SPR生物傳感器相配合用以檢測酸菜液內微生物的含量，其工作過程及結構與檢測工藝流程相匹配，從而實現從人工操作到自動操作的轉化。應用SPR生物傳感器檢測的操作步驟如圖1所示，在符合檢測原理的前提下，要保證各測定步驟的連續性。

2 儲液檢測裝置的結構設計

SPR生物傳感器的檢測主要有浸泡和流通池兩種方法，由于流通池法的液體進出管口徑較小（見圖2中的上、下兩根黑色塑料管），對被檢測液體要求很高，如含有大顆粒物質極易堵塞管路，檢測范圍受到限制，因此本設計采用浸泡法。

圖2 帶有流通池的傳感器頭Fig.2 Sensor head with a flow cell

綜合各方面因素，利用浸泡式檢測形式的特點，模仿人手操作的結構，結合SPR生物傳感器的檢測工藝流程，對儲液檢測裝置進行設計，具體結構如圖3所示。本儲液檢測裝置的主要結構包括:

①定位及取樣機構 固定SPR生物傳感器，實現SPR生物傳感器的浸泡式檢測。

②儲液機構 與SPR生物傳感器的檢測過程相配合，并且轉動方向與檢測步驟相同。

③傳動機構 將檢測步驟與傳感器運動相連接，保證SPR生物傳感器的運動過程與檢測步驟相配合，完成浸泡式檢測。

圖3 SPR生物傳感器檢測裝置總體結構Fig.3 Overall structure of SPR biosensor detection device

2.1 定位夾持機構的設計

SPR生物傳感器的浸泡式檢測需要人手固定扶持，在檢測過程中，人手會產生生理性抖動，影響檢測結果的準確性與精度。針對這些問題，本裝置設計定位夾持機構，本機構是模仿人手捏住的方式進行夾持，添加定位片對傳感器的位置進行固定，可以防止在檢測過程中因晃動影響檢測結果。由圖4可知，傳感器頭的外形、厚度較小，外殼為非金屬材料、硬度較小，易受到損壞，且浸泡式檢測時要求金膜（圖4中部矩形區域）為水平狀態，所以設計中采用彈簧柔性夾緊，夾緊力施加在傳感器頭的插座上，并且增設定位片進行定位，具體設計方案如圖5所示。

定位夾持機構包括四部分:上夾具、下夾具、定位片和扭轉彈簧。通過扭轉彈簧將上下夾具連接，利用彈簧的彈性形變的特性，實現對傳感器的夾緊。定位夾緊機構的設計在保證傳感器頭使用穩定的同時，提高了其傳感作用區的定位檢測精度。從而進一步保證檢測結果的準確性。

圖4 傳感器頭及其插座Fig.4 Sensor head and its socket

圖5 夾具定位夾持機構Fig.5 Structure of positioning fixture

2.2 連續取樣機構的設計

連續取樣機構是保證整個裝置準確檢測的核心部分，作用是配合各檢測步驟，適時升降傳感器頭，完成傳感器浸入法檢測過程。SPR傳感器作用區的面積較小，且在檢測時要求傳感器穩定升降，并使傳感器頭浸入到液面下要求的深度，考慮到傳感器的運動方式和運動穩定性，選擇螺桿螺母副的滑動螺旋傳動方式，主要參數為:公稱直徑20 mm，螺紋長度40 mm，旋向為右，節距4 mm，螺母厚度10 mm，從而保證運動過程穩定性和檢測結果準確性。

具體設計方案（見圖5（b）、6和7）:

圖6 螺桿螺母傳動結構Fig.6 Schematic diagram of screw drive

圖7 導軌與夾具座配合Fig.7 Block diagram with rails and fixtures

①選用的梯形螺紋的強度和對中性較好，可以消除因磨損而造成的間隙，這樣既可以增加傳感器升降的穩定性，同時又能較好的保證升降位移的準確性（圖5（b）和圖6中的螺紋）。

②螺母一側采用T型結構（見圖6），使螺母僅具有1個自由度，即沿軸向的移動，保證了同軸的對中性。

③設計有與夾具T型結構相配合的T型導軌（如圖5（b）和圖7所示），對螺母起到導向作用，同時限制了螺桿（即絲杠傳動軸）的撓性變形，起到了間接固定螺桿的作用。

④從實用性和強度要求方面考慮，螺桿材料采用強度和硬度較高的尼龍，螺母選用相對較軟的聚四氟乙烯（F4）材料，這樣可滿足裝置質量和檢測工藝的要求。

如圖6和圖7所示，連續檢測機構包括三部分:傳感器夾具座、絲杠齒輪傳動軸和導軌。傳感器夾具座通過內螺紋與絲杠齒輪軸上部的螺桿相配合，通過絲杠齒輪軸的往復轉動，帶動傳感器夾具座實現上升和下降運動，夾具座上裝有SPR傳感器的定位夾持機構，從而實現了SPR生物傳感器的浸泡式檢測方法。傳感器夾具座上的T型結構與導軌上的T型槽相配合的，通過固定導軌，對夾具座起到約束作用，使其只能軸向運動，保證傳感器運動的精確性。

2.3 儲液機構的設計

設計儲液機構時，主要解決兩方面問題:材料選擇、與SPR生物傳感器配合方式確定。儲液機構盛裝的液體，除了待檢測的樣品外，還有生物和化學試劑。因此既要防止承載器具污染試劑，還要避免試劑腐蝕器具。通過分析多種材料的耐腐及強度特性，選擇F4作為儲液機構的材料。F4具有較強的防腐性能，還可以融入其他材質加強其硬度和強度，以滿足承載等方面的要求。

儲液機構的結構特點:采用圓盤結構（見圖8），配有與檢測步驟數相同的儲液槽（15個槽），通過棘輪結構的轉動帶動其旋轉參數為:齒數15 mm，模數4 mm，齒距15.57 mm，齒高3.5 mm，頂圓直徑60 mm。實現單向周期循環運動。棘輪有15個齒，與儲液盤的槽數相同，并且二者之間為過盈配合，這使得棘輪每轉過一個齒，儲液盤恰好轉過一個儲液槽，這樣既實現了與SPR生物傳感器檢測順序的配合，又避免了試劑的頻繁更換。

只在存放待檢測樣品的槽上設置注液口，可以在一個樣品檢完排出后，直接注入下一個待檢樣品，這樣可避免人手直接接觸待檢測樣，保證了操作人員的安全，同時又防止樣品的污染。

圖8 儲液機構Fig.8 Diagram of reserve liquid mechanism

2.4 傳動機構的設計

2.4.1 結構的分析

傳動機構是整個裝置的執行部分，可實現SPR生物傳感器的往復運動與儲液盤單向轉動相配合，保證實現浸入式檢測。圖9是螺旋傳動、齒輪傳動和棘輪相結合的多級傳動結構簡圖。運動和轉矩由輸入軸（絲杠齒輪軸）輸入，輸入軸上固結有螺桿和輸入齒輪Z1，螺桿帶動螺母上下移動，齒輪Z1帶動齒輪Z2，Z2固結在傳動軸1（一級傳動齒輪軸）上，同時使固結在傳動軸1上的齒輪Z3轉動，Z3帶動固結在傳動軸2（二級傳動齒輪軸）上的齒輪Z4轉動，驅使鉸鏈在Z4上的棘爪與其一起運動，并推動空套在傳動軸2上棘輪轉動，從而使與棘輪相連的儲液盤相應轉動。通過輸入軸順、逆兩向轉動，從而實現夾具的上升與下降。傳動機構的傳動原理如圖10所示。由于整個傳動輸入為往復運動，而輸出為單向運動，因此，輸出端采用棘輪機構，從而實現步進的間歇運動，當輸入軸反向轉動、夾具上升時，止回棘爪制動棘輪，最終使儲液盤只能單向旋轉。

圖9 多級傳動Fig.9 Multi-level transmission

圖10 多級傳動原理分析Fig.10 Analysisof multi-level driving principle

2.4.2 傳動比及運動分析

傳動機構工作時，夾具每升降1次儲液盤轉過1個槽，棘輪設計有15個棘齒以配合儲液盤的15個槽。考慮到整個裝置的結構尺寸、夾具的升降位移以及穩定性等因素，選擇螺桿傳動（螺桿具體參數見表1），每轉動2周，夾具上升或下降1次，因齒輪傳動精度高、穩定性好，所以采用此傳動方式進行多級傳動，總傳動比為30。各齒輪之間的傳動嚙合、速度關系如圖10所示。

根據傳動誤差和回差最小的原則，確定最佳傳動級數為:

一般單級傳動級數不超過8，圓整n到接近的整數值，即取n=2。

輸入齒輪Z1與齒輪Z2間的傳動比為:

式中:z1，z2-分別為齒輪Z1和Z2的齒數。

式中:z3，z4-分別為齒輪Z3和Z4的齒數；

且整個傳動系統的總傳動比為:

從傳動的平穩性及精度方面考慮，兩級傳動比差距不宜過大，故選擇i12=5，i34=6。根據機械設計手冊要求，一般漸開線圓柱直齒輪z1常用取值范圍為17≤z1≤28，取z1=20。各齒輪的具體參數如表3，這樣可以確定齒輪上各嚙合點及連接點的速度關系。圖10中O4點為棘爪在齒輪Z4上位置。

表1 各齒輪傳動的參數Table1 Parameters of the gear drive

2.5 控制系統的設計

對上述各部件進行組裝，得到如圖11所示的檢測裝置，通過自行設計的單片機控制系統，可以按照試驗步驟要求實現自動檢測。整套控制系統由電機驅動模塊、微控制器模塊、顯示模塊、按鍵、電源及步進電機等部分組成（見圖11中13-18），通過編程控制電機的正反轉及間歇時間，實現與試驗步驟相配合的自動檢測目的，并且通過按鍵可以根據需要對間歇時間進行調整。在自動運行時能通過顯示屏直觀的觀察檢測系統運行情況，能夠手動停止。

圖11 檢測裝置及控制系統實物Fig.11 Physical chart of the detecting device and control system

3 酸菜液中大腸桿菌濃度測定

3.1 試驗目的及方法

應用本套裝置與SPR生物傳感器器相配合，對隨機選取的酸菜液進行大腸桿菌（E.coli O157）含量的檢測，并對檢測結果進行分析，得出其中大腸桿菌E.coli O157的濃度值，并與實驗室常規方法的檢測結果進行比較，驗證測量結果的準確性及裝置的可用性。

3.2 試驗內容

3.2.1 試驗方法與步驟

采用美國Texas Instruments公司生產的集成化手持式SpreetaTMSPR傳感器。將事先配制好的試劑裝入儲液盤相應的槽內，把傳感器固定于傳感器夾具上，調試好后，實施如下檢測步驟:

①校準傳感器，在空氣中的index值為0；

②去離子水中的index值為1.333。

③清洗傳感器金膜表面，將傳感器金膜表面浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in H2O溶液中3 min；

④將傳感器浸入10mL磷酸鹽緩沖液（PBS）3 min；

⑤結合親和素，將傳感器浸入10mL親和素（NeutrAvidin）3 min；

⑥沖洗過量的親和素（NeutrAvidin），將傳感器浸入10mL PBS 3 min；

⑦結合抗體，將傳感器浸入10mL 300μg·mL-1生物素化抗體（Antibody）中10 min；

⑧沖洗游離的抗體，將傳感器浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in PBS中2 min；

⑨將傳感器浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in PBS中2 min；

⑩將傳感器浸入10mL牛血清白蛋白（BSA）中2 min；

試驗各步驟之間的轉換及檢測時間通過本裝置的控制系統自動控制，待檢測樣品通過系統控制由管路定時注入，無需人手工操作。其中1號樣品的監測曲線如圖12所示。

圖12 1號樣品的監測曲線Fig.12 Detection curve of sample 1

3.2.2 驗證實驗

采用國標GB4789.2-94中提到的常規檢測方法-平板菌落計數法（細菌總數的測定），對同一樣品進行檢測，其檢測結果作為實際值。在無菌操作臺內將待測樣品做10倍稀釋，選取1∶1000、1∶10000和1∶100000這三個稀釋度，每個稀釋度都做了2個平行樣。每個樣品的菌落總數的稀釋度選取原則和菌落總數的詳細計數方法，具體參見國標GB4789.2-94。最終得到6組實際值。

3.3 試驗結果與討論

將檢測試驗得到的6組測量值與驗證實驗得到的6組實際值進行比較分析，結果如表2所示。

表2 試驗數據分析Table2 Analysis of test data

通過分析結果可知，誤差值小于5%，說明測量值較準確，應用本套裝置檢測酸菜液內大腸桿菌E.coli O157是準確的、可信的。

4 結論

本文針對現階段發酵食品在線檢測存在的問題，分析應用SPR生物傳感器檢測的優越性，結合其檢測工藝要求，研制了一個連續取樣檢測裝置。提出了一種多傳動方式相結合的傳動機構-滑動螺旋傳動、齒輪傳動和棘輪間歇運動機構。討論了其傳動原理和具體機構的實現形式，給出了實用的傳動結構。將傳感器頭的直線升降往復運動與儲液盤的圓周單向轉動相連接，實現周期性循環檢測的性能。通過應用自行設計的控制系統，減少了人工操作，基本實現了從人工操作向自動化檢測的轉化。并且應用本裝置對酸菜發酵液中大腸桿菌E.coli O157的濃度進行了檢測，并對檢測結果進行驗證，誤差值小于5%，證明了本裝置的可用性。

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