試管擴散法檢測牛乳中β-酰胺類抗生素殘留研究

吳 瑕，邵 輝，王 鑫，張蘭威

（1.東北農業大學成棟學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江龍丹乳業有限公司，哈爾濱 150046；3.哈爾濱工業大學食品科學與遺傳工程研究院，哈爾濱 150001）

抗生素在畜牧業的廣泛應用，不可避免地造成牛乳中的抗生素殘留。具有β-內酰胺環的抗生素如青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素等在奶牛養殖業中常用于治療奶牛乳房炎，由于其廉價和廣譜的抗菌性而被大量且頻繁地超劑量使用，因此導致了牛乳中高濃度的β-內酰胺類抗生素殘留。牛乳中抗生素殘留的原因主要是非治療目的用藥、治療目的用藥和非法人為摻雜[1]。

對抗生素有過敏體制的人服用抗生素殘留的牛乳后，會發生過敏反應如皮疹、過敏性休克等[2]。李銀生曾報道，英國一對青霉素高度敏感的病人，使用含約10 IU·mL-1的青霉素的商品牛乳后，發生了變態反應[3]。長期飲用則會抑制人體腸道中敏感菌群的生長，并會導致人體對抗生素產生耐藥性，給臨床治療帶來不可估量的麻煩[4]。從乳品加工的角度看，原料乳中抗生素殘留嚴重影響干酪、黃油、發酵乳的起酵和后期風味的形成[4-6]。因此，牛乳中的β-內酰胺類抗生素殘留一直是各國政府和食品安全機構關注的重點。WHO和歐盟法典規定的青霉素G在牛乳中的最大殘留限制（MRL）為4μg·kg-1，FDA規定的最大檢出量為5μg·kg-1[7]。

用于檢測牛乳中青霉素G殘留的方法，目前國內主要依據國家標準GB4789.27-94進行，此方法操作簡單，比較適合基層單位使用，但其靈敏度低，對乳中青霉素G的檢測限僅為0.04 U·mL-1，已不適應國際需要。國外已研制出檢測牛乳中β-內酰胺類抗生素殘留的各種類型的試劑盒，如以微生物受阻法為原理的Delvotest試劑盒、免疫受體檢測試劑盒如SNAP試劑盒等，但因受到使用成本、操作難易程度、對主要設備要求以及供貨連續性等眾多因素的影響，還沒有在我國得以廣泛推廣[8]。

試管擴散法是以微生物受阻法為基本原理，用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為指示菌，在培養基中加入指示劑，當牛乳中無抗生素殘留時，嗜熱脂肪芽孢桿菌在牛乳中生長產酸使指示劑變色；若牛乳中有抗生素殘留，則嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長受到抑制，指示劑保持紫色不變。依據這一現象，確定牛乳中β-內酰胺類抗生素殘留。本研究的目的是比較試管擴散法同TTC法（GB4789.27-94）的優劣，從而確定試管擴散法在實際應用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，Bs）（中科院微生物研究所）。

1.1.2 主要培養基

胰蛋白胨大豆（瓊脂），平板計數瓊脂。

1.1.3 主要試劑及原料

青霉素G、氨芐青霉素、苯唑青霉素（新青霉素Ⅱ）、頭孢吡啉（頭孢菌素Ⅷ）、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶（美國SIGma公司）；羥氨芐青霉素（阿莫西林）、頭孢氨芐（先鋒霉素Ⅳ）（國家藥檢所）；苯基丁氮酮（法國Vetam公司）；脫脂乳粉和全脂無抗乳粉（購于國家乳品檢測中心）；溴甲酚紫、TTC（天津科密歐化學試劑開發中心）；SNAP試劑盒（龍丹乳品公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗用不含抗生素的牛乳

無抗牛乳:由無抗全脂奶粉復原而成，濃度為10%（W/V），并用SNAP試劑盒檢測以確定其是無抗生素殘留牛乳樣品。

1.2.2 抗生素殘留奶樣的制備

將抗生素貯備液與經過檢測證明無抗生素殘留的奶樣混合制成濃度為0.25×MRL、0.5×MRL、1.0×MRL、1.5×MRL和2.0×MRL五個濃度的抗生素殘留奶樣。

1.2.3 Bs菌液的制備

把標準菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌保存于胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，每3周轉種1次。以下面方法制備芽孢懸液:接種芽孢培養基，于64±2℃培養，當80%芽孢形成時（一般需72 h）即可停止培養，取出培養液離心，5000 r·min-1離心15 min，傾去上清夜，再次把細胞懸浮于滅菌生理鹽水中并再次離心，如此反復洗滌，最后把洗滌過的芽孢懸浮于30mL滅菌生理鹽水中，并于4℃保存。芽孢懸液能保存6～8個月。用準備好的試驗平皿定期檢查活力。制備好的芽孢懸液采用生理鹽水進行梯度稀釋，選取適當稀釋度涂布于平板計數培養基上，55℃24 h培養后，用標準平板計數方法計算，應達到107cfu·mL-1。

1.2.4 試管擴散法檢測過程

檢測時檢測培養基分裝到18 mm×180 mm的試管中，待用，檢測前，先將受檢乳樣80℃處理2 min，冷卻到室溫后加入苯甲基丁氮酮，吸取待檢樣品加到已裝有培養基的試管中，然后將加入了受檢乳樣的試管經70℃水浴10 min后放入63℃水浴中，檢測時用無抗生素殘留牛乳作為陰性對照，陽性對照濃度為2.5×MRL。結果判斷的時間以陰性對照由紫色變為黃色的時間為準。試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素，每個濃度重復30次，得到試驗結果的確定依據顯色判斷標準如表1所示。

1.2.5 TTC法操作步驟

按照GB4789.27-94操作。本試驗采用TTC法檢測6種β-內酰胺類抗生素時，每個濃度重復4次，每次做2個平行。

1.2.6 實測結果分析

由牛奶收購站及市場采集鮮牛乳樣品70份，同時用試管擴散法、TTC法進行對比測試，為了進一步證實，同時采用SNAP檢測試劑盒進行驗證。比較三種方法進行檢測得到的陽性率，從而比較試管擴散法和TTC法在實際應用中的優劣。

表1 試管法結果判斷顏色依據Table1 Colour judgement basis of results by tube diffusion test

2 結果與分析

2.1 試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素

試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素得到的結果見彩版Ⅰ。

彩版Ⅰ中1號與2號試管培養基變為黃色表示結果為陰性，3號試管變為黃紫色表示結果為可疑，4號和5號兩個試管變為紫色表示結果為陽性，6號試管為未添加奶樣的檢測培養基。由彩版Ⅰ可以看出，檢測結果的顏色梯度較為明顯。符合表1中試管擴散法結果判斷依據中對顏色的規定。

2.2 試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素的檢測限

檢測時，每個濃度重復30次，結果見表2。

由表2可以看出，試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素可以達到1.0×MRL的殘留濃度，對于0.5×MRL殘留濃度的檢測上，頭孢氨芐不能檢出，其他5種抗生素陽性檢出率不足90%，因此試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素殘留的檢測限為1.0×MRL，符合歐盟法典規定的牛乳中6種β-內酰胺類抗生素殘留的最大殘留限制（MRL）[7]。

表2 試管擴散法檢測6種β-內酰胺類抗生素得到的結果（n=30）Table2 Results of testing 6 kinds of β-lactam antibiotics by test tube method(n=30)

2.3 用TTC法檢測6種β-內酰胺類抗生素的檢測限

用TTC法檢測6種藥物殘留的結果如表3所示。

2.4 試管擴散法實際應用情況結果分析

由牛奶收購站及市場采集鮮牛乳樣品70份，同時用試管擴散方法和TTC法進行對比試驗，為了進一步證實結果的可靠性，同時采用SNAP分析方法進行驗證。用3種方法測試得到的陽性率如表4所示，具體的分析結果如表5、6和7所示。

表3 試管擴散法和TTC法檢測6種藥物殘留的結果（n=4）Table3 Residue results of 6 kinds of drug by the tube diffusion test and TTC(n=4)

表4 70份牛乳樣品檢驗結果Table4 Detecting results of 70 milk samples

表5 試管擴散法和SNAP試劑盒檢測結果比較Table5 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and SNAP method

表6 試管擴散法和TTC法檢測結果比較Table6 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and TTC method

表7 TTC法和SNAP試劑盒檢測結果比較Table7 Comparison of the detecting results between TTC and SNAP method

由表5可以看出，試管擴散法和SNAP檢測法具有較高的一致性。試管擴散法檢測為陽性的14份樣品，經SNAP試劑盒檢測結果也為陽性，而試管擴散法檢測為陰性的5份樣品經SNAP試劑盒檢測結果為陽性，原因可能是奶樣中藥物殘留的濃度接近SNAP法的檢測限（青霉素G3.5μg·kg-1，頭孢吡啉3.5μg·kg-1）但是低于試管擴散法的檢測限（青霉素G:4μg·kg-1頭孢吡啉，頭孢吡啉:60μg·kg-1）。用試管擴散法檢測為陽性的3份樣品經SNAP法檢測為陰性，原因可能是奶樣中藥物殘留的濃度高于試管擴散法的檢測限（氨芐青霉素和羥氨芐青霉素的檢測限為4μg·kg-1）但低于SNAP法的檢測限（氨芐青霉素的檢測限為8.2μg·kg-1，羥氨芐青霉素檢測限為8μg·kg-1）。

由表6可以看出，經試管擴散法檢測為陽性的17份樣品，經TTC法檢測只有4份為陽性，其余結果均為陰性，原因是TTC法檢測為陽性的樣品殘留濃度較高，而TTC法檢測為陰性的樣品殘留濃度低于TTC法的檢測限但高于試管擴散法的檢測限（1.0×MRL），因此TTC法在檢測限上已經不符合國際要求了。表7也說明了這個問題，由SNAP法檢測為陽性的19份樣品，TTC法只檢出了4份陽性，其余15份則檢測為陰性，從SNAP的讀數儀上可以看出TTC法檢出的15份陰性樣品顯示的數值較大，即殘留的濃度較高，因此說明TTC法已不適應現實需要了。

3 討 論

從檢測限上比較，試管擴散法能夠檢測β-內酰胺類抗生素中的多種抗生素殘留，檢測限符合國際標準1.0×MRL，而TTC法檢測青霉素G殘留的檢測限已不符合國際標準，而對于β-內酰胺類抗生素中除青霉素G以外的其他抗生素殘留的檢測未作說明，經本試驗檢測，TTC法不能檢出等于或低于國際標準1.0×MRL的β-內酰胺類抗生素殘留；試管擴散法同AOAC認證的方法SNAP試劑盒具有較高的一致性，說明試管擴散法可以進一步開發為檢測牛乳中β-內酰胺類抗生素殘留的商業方法。從檢測時間上比較，TTC法檢測時間至少3.5 h，而試管擴散法檢測時間為3 h 10 min；雖然有所縮短，但程度不大，這也是試管擴散法存在的不足。接下來的研究工作將從縮短試管擴散法的檢測時間入手，可嘗試通過誘變育種篩選出產酸時間較短的嗜熱脂肪芽孢桿菌，或者將微生物法和免疫受體法結合起來等研究方法，以達到縮短檢測時間的目的。

4 結論

研究結果表明，用試管擴散法檢測牛乳中的β-內酰胺類抗生素殘留有一定的研究意義，較之于其他微生物方法，該方法操作簡單易于掌握，不需要特殊儀器，且靈敏度能夠達到國際要求；與國際認證的標準方法具有較好的協同性。唯一不足的，也是關鍵就是試管擴散法與國際上商業檢測方法比，檢測時間偏長為3 h 10 min，相信在進一步研究后，此方法可應用于牛乳中青霉素G殘留量的檢測。

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