利用短小芽孢桿菌發酵馬鈴薯渣生產單細胞蛋白飼料的研究

張向東，楊 謙，余 佳，趙 磊，范金霞

（哈爾濱工業大學生命科學學院，哈爾濱 150001）

蛋白質資源短缺是全世界面臨的重大難題，各國都很重視開發新型蛋白資源的研究。單細胞蛋白，是指非致病性真菌、酵母細菌等單細胞微生物體內所含蛋白質。含量高達細胞干重的45%～74%，且各種氨基酸搭配合理、種類齊全，維生素豐富等[1]。日益成為諸多科研工作者研究的重心[2-3]。單細胞蛋白的生產以食品工業廢料[4-5]、農副產品下腳料及農作物纖維等為主要原料[6-7]，不僅來源廣泛、生產成本低廉，而且對要求日益嚴格的環保問題，也體現著不可估量的價值[8]。我國千余家馬鈴薯淀粉廠每年產生的馬鈴薯薯渣與汁水超過340萬t，薯渣與汁水中營養豐富含有大量的纖維素半纖維素，氨基酸、維生素、粗蛋白、微量元素等[9-10]，汁水的 COD（Chemical oxygen demand）在25000～30000之間。由于缺乏科學有效的處理技術，使淀粉生產過程中產生的薯渣和污水任意排放，造成嚴重的環境污染，產生不良的社會影響[11]。本研究以短小芽孢桿菌為發酵菌種，以馬鈴薯薯渣與汁水為原料，在不添加任何其他成分的情況下，初步獲得了以馬鈴薯薯渣與汁水為原料生產單細胞蛋白的方法，所獲得的發酵產物中精蛋白含量高，氨基酸組成均衡。在小鼠采食量與增重測試中均表現出優于同等質量豆粕。因此，本項工藝不僅解決環境污染的問題同時又生產了優質的單細胞蛋白，具有重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與大小鼠

短小芽胞桿菌（B.pumilus）ZY05是本實驗室保存的菌種，Wistar大鼠、昆明白小鼠購自哈爾濱醫科大學。

1.1.2 培養基

LB培養基:每1000mL中含有蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；pH 7.0，制作固體培養基時需加入20 g瓊脂粉。

發酵培養基:馬鈴薯薯渣與汁水半固體培養基（大興安嶺麗雪精淀粉公司），依照生產實際比例混合。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

從斜面上挑取1環短小芽胞桿菌（B.pumilus）接種于LB液體培養基中，在37℃，150 r·min-1振蕩培養12 h。菌液經離心以及去離子水清洗后，再用去離子水稀釋至OD6001.0作為種子。

1.2.2 發酵產物中精蛋白含量的測定

應用雙縮脲法測定精蛋白的含量[12]。

1.2.3 發酵產物中氨基酸組成的測定

應用全自動氨基酸分析儀測定發酵產物中氨基酸的組成[13]。

1.2.4 發酵產物中胰蛋白酶抑制因子含量的測定

胰蛋白酶抑制因子含量的測定具體見參考文獻[14]。

1.2.5 發酵產物急性毒理試驗

選用Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重為180～220 g。采用最大耐受量試驗方法，實驗大鼠在本實驗室適應環境3 d，禁食16 h后經口一次灌胃，樣品用羧甲基纖維素做成混懸液灌胃，大鼠的灌胃容積為20mL·kg-1BW，灌胃劑量為10 g·kg-1BW。觀察大鼠的中毒表現和死亡時間，觀察時間為14 d。

1.2.6 鼠糧的制作

鼠糧配方如下表1所示。

表1 鼠糧配方Table1 Rat food formula (%)

鼠糧配置方法:首先配置不含有氮源的半成品鼠糧，根據試驗的需要分別以同質量的薯渣、豆粕與短小芽孢桿菌的發酵產物作為氮源制作塊狀成品鼠糧。

1.2.7 發酵產物小鼠日采食量與增重的測定

取60只（雄雌各半）出生20 d小鼠，均分成3大組，每組20只雄雌各半，小鼠禁食水24 h后編號喂水喂食，通過超量投擲鼠糧、每4 d計算鼠糧減少量可知小鼠在單位時間內的采食量。同時測量小鼠體重增加量。

測得數據應用Excel 2003運算并繪圖。

2 結果與分析

2.1 出發酵時間對精蛋白產量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），在30℃，150 r·min-1振蕩培養，從圖1可知精蛋白在120 h出現高峰達到發酵后干物質總重量的17.81%。

2.2 發酵溫度對精蛋白產量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），分別于20、25、28、30、33、37、40 ℃培養，150 r·min-1振蕩培養，發酵120 h測量精蛋白含量，從圖2可知37℃發酵時發酵液中的精蛋白含量最高達到發酵后干物質含量18.8%。

圖1 發酵時間對精蛋白產量的影響Fig.1 Influence of fermentation time on protein yield

圖2 發酵溫度對精蛋白產量的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on protein yield

2.3 發酵通氣量對精蛋白產量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），在37℃分別于90、120、150、180、210、240、300 r·min-1振蕩培養，發酵120 h測量精蛋白含量，從圖3可知，在振蕩培養時轉速在180 r·min-1時精蛋白產量最大達到發酵后干物質含量19.5%（見圖3）。

2.4 接菌量對精蛋白產量的影響

短小芽孢桿菌分別以0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2.0%的接菌量（體積比），在37℃分別于180 r·min-1振蕩培養，發酵120 h測量精蛋白含量，從圖4可知，接菌量分別為0.8%、1%、1.5%、2.0%時單細胞蛋白含量區別很小（見圖4）。

圖3 發酵通氣量對精蛋白產量的影響Fig.3 Influence of fermentation ventilation on protein yield

圖4 接菌量對精蛋白產量的影響Fig.4 Influence of inoculation quantity on protein yield

2.5 發酵產物氨基酸組成分析

短小芽孢桿菌以0.8%的接菌量（體積比），在37℃，180 r·min-1下振蕩培養，發酵120 h測量氨基酸組成，由表2可知，發酵產物氨基酸組成均衡全面。

表2 氨基酸組成分析Table2 Amino acid composition analysis （%）

2.6 胰蛋白酶抑制因子活性

胰蛋白酶抑制因子是主要抗營養因子，發酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%（見圖5）。提高了營養成分的吸收效率及適口性。

圖5 發酵時間對胰蛋白酶抑制因子的影響Fig.5 Influence of fermentation time on TI

2.7 發酵產物的急性毒理試驗

大鼠的急性毒性試驗結果見表3，可知發酵產物不含有急性毒性成分。

2.8 小鼠平均采食量試驗

小鼠的平均采食量見圖6。由圖6可知，小鼠對發酵產物的日采食量優于同等質量的豆粕，小鼠采食量的增加有利于小鼠吸收更多的營養。

2.9 小鼠平均增重試驗

小鼠的平均增重見圖7。由圖7可知，食用薯渣發酵產物的小鼠平均增重優于食用同等質量豆粕的小鼠，平均增重是表現飼料品質的重要方面，薯渣發酵產物可替代豆粕作為飼料應用于動物飼養。

表3 大鼠急性毒性試驗結果Table3 Rats acute toxicity tests results

圖6 小鼠平均采食量Fig.6 Mice average intake

3 討論

國內外利用馬鈴薯生產淀粉過程中，均產生大量的薯渣和汁水，馬鈴薯薯渣和汁水的主要成分是纖維素和蛋白質等。由于在生產淀粉過程中，需要添加一些化學物質，適口性差，因此產生的薯渣不能直接被畜禽利用，馬鈴薯薯渣不能直接作為動物飼料。而汁水COD高達25000～30000，馬鈴薯薯渣與汁水的處理一直是世界性的難題。馬鈴薯薯渣與汁水中含有豐富的營養物質能夠通過微生物發酵獲得單細胞蛋白，本研究優化了利用短小芽孢桿菌發酵馬鈴薯薯渣與汁水生產優質的單細胞蛋白的工藝，結果獲得的發酵物中精蛋白含量達到19.23%，氨基酸全面均衡。

圖7 小鼠平均增重Fig.7 Mice average weight gain

抗營養因子[15]破壞營養成分，阻礙營養成分的消化吸收，抗營養因子還直接影響飼料的適口性，嚴重影響蛋白飼料的品質。胰蛋白酶抑制因子是最主要的抗營養因子，薯渣與汁水發酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%，小鼠在以薯渣為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.04 g，在以豆粕為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.74 g，在以短小芽孢桿菌發酵產物為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.93 g；在小鼠采食量方面發酵產物優于豆粕，采食量在一定程度上反應了飼料的適口性，能夠增加小鼠的采食欲望。通過小鼠的飼養試驗可知小鼠在以薯渣為氮源的鼠糧中平均增重為12.6 g，小鼠在以豆粕為氮源的鼠糧中平均增重為17.3 g，小鼠在以短小芽孢桿菌發酵產物為氮源的鼠糧中平均增重為20.9 g；通過小鼠采食量與增重試驗可知薯渣與汁水的發酵產物優于同等質量的豆粕，能夠替代傳統的豆粕飼料。本工藝如能得到產業化應用將極大的改變我國飼料蛋白短缺的現狀[16]。

通過大鼠急性毒理試驗以及小鼠的28 d飼養試驗可知發酵產物產物安全無毒，作為蛋白飼料可以放心使用，在解決環境污染問題的同時實現了資源的綜合利用。

4 結論

a.通過短小芽孢桿菌對馬鈴薯薯渣與汁水的發酵條件的單因子分析可知最佳發酵條件即0.8%的接菌量（體積比），37℃于180 r·min-1振蕩培養，發酵120 h。

b.通過對發酵產物精蛋白質含量以及氨基酸組成分析，馬鈴薯薯渣與汁水發酵后精蛋白含量達到干物質含量的19.23%，氨基酸組成全面，具有作為蛋白飼料的潛力。

c.發酵產物通過大鼠急性毒理試驗與小鼠28 d飼養試驗證明無毒無害。

d.通過小鼠采食量與增重試驗可知所獲得發酵產物優于同等質量的豆粕，獲得的高品質單細胞蛋白實現了廢棄物的資源化，能夠替代豆粕，具有良好的應用前景。

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