大豆7S、11S球蛋白亞基缺失突變體豆腐加工特性的鑒定

刁桂珠，潘俊波，姜自芹，葛玉君，鄭天慧，曾 蕊，吳 帥，宋 波，拓 云，劉珊珊*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，哈爾濱 150040）

豆腐是中國(guó)、日本等國(guó)家的傳統(tǒng)大豆食品，大量研究已證實(shí)，大豆種子貯藏蛋白球蛋白的含量及7S與11S球蛋白亞基的組成對(duì)豆腐的產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)、加工品質(zhì)有顯著影響。

7S和11S球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的主要組分（約占大豆種子蛋白總量的70%左右），也是豆腐營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)的主要決定因子，二者的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工特性均有差異。在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面，11S球蛋白含硫氨基酸的含量比7S球蛋白的高[1]，11S與7S球蛋白各亞基蛋氨酸的含量差異可達(dá)3～4倍[2-3]。Kitamura等研究表明，7S球蛋白含量的降低會(huì)導(dǎo)致11S球蛋白含量的補(bǔ)償性增加[4]，因此，低7S品系大豆的蛋白總量不會(huì)降低，另外他們得到的低7S品系含硫氨基酸的含量比普通品種高出20%。在加工特性方面，F(xiàn)ukushima等研究表明11S球蛋白的亞基組成在豆腐的成膠特性中起著重要的決定作用[5]，在熱誘導(dǎo)成膠過(guò)程中，11S球蛋白的Ⅱa亞基與成膠率和透明度密切相關(guān)，而Ⅱb亞基則與凝膠的硬度相關(guān)[6]。Saio等對(duì)11S與7S球蛋白的成膠性進(jìn)行比較，結(jié)果表明用11S球蛋白制得的豆腐比7S球蛋白的硬度大[7]。可見(jiàn)，增加11S球蛋白的含量、降低7S球蛋白的含量可以提高大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，調(diào)節(jié)二者的比例可以改善大豆蛋白的加工適應(yīng)性品質(zhì)。

大豆7S球蛋白部分亞基缺失材料屬于低7S品系，是優(yōu)質(zhì)豆腐專用品種選育的重要親本來(lái)源。本研究對(duì)利用7S球蛋白α′-缺失型、[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型和 β-少型（低7S含量）大豆材料加工的豆腐進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及加工特性的分析、鑒定，以求明晰引進(jìn)稀有低7S含量種質(zhì)的利用潛力，為優(yōu)質(zhì)豆腐用大豆品種的選育提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

三氨基甲烷（Tris）、尿素（Sigma公司），十二烷基磺酸鈉（SDS）、烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為AMRESO產(chǎn)品，甲基乙二胺（TEMED）、巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲醇、冰乙酸、鹽酸，硫酸鈣等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 供試大豆

采用黑龍江省主栽高蛋白品種東農(nóng)42（對(duì)照），及國(guó)外引進(jìn)的7S、11S球蛋白亞基組成各異的大豆材料日A-5（α′-缺失型）、日B-1[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型和越南褐臍（β-少型）作為豆腐加工原料。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白亞基組成分析（SDS-PAGE電泳法）

稱取5 mg大豆粉，加入0.5mL抽提緩沖液（0.05 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0，0.2%SDS，5 mol·L-1尿素）充分混勻，靜置過(guò)夜（室溫），加入10μL巰基乙醇，充分混勻，14000 r·min-1，4℃離心，15 min，取20μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色。SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 小樣本大豆豆腐加工方法

實(shí)驗(yàn)室豆腐加工參考Shen等、Wang等、裴東紅等和周新安等的方法[8-11]，并作了一些修改，具體操作步驟如下:大豆原料經(jīng)挑選除雜質(zhì)后稱取籽粒50 g，加500mL蒸餾水，在室溫下浸泡16 h，除去沒(méi)有完全被吸收的水，清洗、瀝干。加300mL蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行磨漿2 min，倒出后用100mL水沖洗搗碎機(jī)（2次）。用通電加熱設(shè)備加熱煮沸，保持5 min（并不時(shí)攪拌進(jìn)行消泡，以防止豆?jié){的假沸）。用4層脫脂紗布過(guò)濾豆?jié){。然后將豆?jié){置于80℃恒溫水浴中，待豆?jié){溫度冷卻到80℃，按體積比1∶10（過(guò)飽和硫酸鈣溶液∶豆?jié){）加入加過(guò)飽和硫酸鈣溶液，邊加邊攪動(dòng)，在80℃下保溫20 min，后破腦壓榨。用7.5 cm×7.5 cm×7.5 cm（L×W×H）墊有4層脫脂紗布的木質(zhì)敞開(kāi)容器作為成型盒，蓋好紗布和木模上蓋，在70℃15.7 g·cm-2壓力下加壓15 min，即得豆腐成品，在4℃下保存?zhèn)溆谩８魈幚碇貜?fù)3次。

1.2.3 豆腐加工品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

豆腐及豆?jié){蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5-85。

豆腐成形后稱其濕重為濕豆腐重。然后取豆腐和豆渣鮮樣各50 g，70℃恒溫烘干（48 h），測(cè)量其干豆腐重及干豆渣重。同時(shí)計(jì)算如下指標(biāo)[11]:

豆腐硬度的測(cè)定:采用STABLE M.I COR公司的TA-XT-PLUS型質(zhì)構(gòu)儀。進(jìn)行兩次壓縮實(shí)驗(yàn)（TPA）。選擇參數(shù)為:P/0.5探頭，測(cè)試前速度5 mm·s-1，測(cè)試速度1 mm·s-1，測(cè)試后速度5 mm·s-1，中間停留時(shí)間為5 s，壓縮比為1∶2，同一樣品選擇3個(gè)不同的部位進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.2.4 不同大豆原料蛋白質(zhì)、脂肪、蛋脂總量的測(cè)定

采用Perten8620近紅外品質(zhì)分析儀測(cè)定不同大豆原料的蛋白質(zhì)、脂肪及蛋脂總量[19]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件及MS excel軟件對(duì)豆腐產(chǎn)量（干豆腐重，濕豆腐重）等豆腐加工品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析及采用LSR法（新復(fù)極差法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。顯著性水平為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試大豆材料7S、11S球蛋白亞基組成及主要品質(zhì)性狀的差異分析

2.1.1 供試大豆材料7S、11S球蛋白亞基組成

用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）對(duì)供試大豆種子貯藏蛋白球蛋白的亞基組成進(jìn)行分析確認(rèn)，結(jié)果如圖1所示。對(duì)照東農(nóng)42（見(jiàn)圖1，第1泳道）為亞基組成正常型，第2泳道為越南引進(jìn)亞基組成為β-極少型越南褐臍、第3泳道為日本引進(jìn)α′-亞基缺失型日A-5，第4泳道為[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-亞基缺失型的日本引進(jìn)稀有種質(zhì)日B-1，以上7S、11S球蛋白亞基組成各異的大豆種質(zhì)生長(zhǎng)發(fā)育正常，為明確以上種質(zhì)的豆腐加工適應(yīng)性，針對(duì)其豆腐的營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。

獲得的SDS-PAGE凝膠采用BIO-RAD Quantity One 4.62凝膠分析軟件，首先進(jìn)行蛋白條帶的識(shí)別，各材料3次重復(fù)間識(shí)別相同的蛋白條帶，不同材料間除了7S、11S的亞基差別外，識(shí)別相同條帶數(shù)，然后軟件自動(dòng)計(jì)算出單個(gè)條帶在整條泳道蛋白上的百分含量，各材料三次重復(fù)的7S、11S球蛋白的三個(gè)亞基相對(duì)含量取平均數(shù)，不同材料7S、11S球蛋白的三個(gè)亞基相對(duì)含量平均數(shù)再進(jìn)行比較，獲得含量變幅，變異系數(shù)的數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知，供試材料間7S、11S球蛋白亞基組成差異顯著，說(shuō)明各材料遺傳變異潛力巨大，在雜交育種的親本選配及優(yōu)質(zhì)豆腐用新品種的選育工作中極具應(yīng)用潛力。其中7S球蛋白α′-亞基相對(duì)含量的變異系數(shù)最大，為1.077；各材料間11S球蛋白Ⅱb、Ⅱa亞基的變異系數(shù)均在75%以上。

圖1 供試大豆種子蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE banding patterns of soybean seed storage proteins

2.1.2 供試大豆材料的主要品質(zhì)性狀

選取豆腐加工品質(zhì)指標(biāo)相對(duì)比較好的大豆原材料，利用Perten8620近紅外品質(zhì)分析儀測(cè)定其蛋白質(zhì)、脂肪的含量，結(jié)果如表2所示。由表2可知，不同大豆原料間的蛋白質(zhì)、脂肪和蛋脂總量均不相同。生產(chǎn)上一般認(rèn)為蛋白質(zhì)含量高于45%的為高蛋白質(zhì)品種；脂肪含量高于21%的為高油品種，脂肪含量大于20%，并且蛋脂總量超過(guò)63%的品種被認(rèn)為是“雙高”品種。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，日A-5符合脂肪含量大于20%，并且蛋脂總量超過(guò)63%的標(biāo)準(zhǔn)，是“雙高”材料。日B-1的蛋白含量為44.9%，比高蛋白品種的標(biāo)準(zhǔn)僅低0.1個(gè)百分點(diǎn)，蛋白質(zhì)含量也較高。

表1 大豆7S球蛋白三個(gè)主要亞基及11S球蛋白Ⅱb、Ⅱa亞基相對(duì)含量變異分析Table1 Variance analysis of relative content of individual subunit of soybean 7S globulin and 11S globulin（%）

表2 不同大豆原料的蛋白質(zhì)、脂肪及蛋脂總量Table2 Protein,fat,protein and fat total contents of different soybean varieties

2.2 不同大豆原料豆腐產(chǎn)量及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀間的差異

豆腐的得率即100 g大豆獲得的濕（鮮）豆腐重，是豆腐商品性的主要指標(biāo)，對(duì)豆腐的商品性有著重要意義，干豆腐重是豆腐得率的又一重要體現(xiàn)。豆腐的得率主要受可溶性蛋白，特別是貯藏蛋白含量的影響。由表3可知，這四個(gè)不同球蛋白亞基變異材料的濕、干豆腐產(chǎn)量的平均數(shù)分別為111.66和19.99 g·50 g-1。品種之間干豆腐重的平均數(shù)變化較大，除了越南褐臍材料之外，品種之間濕豆腐重的平均數(shù)變化不大。濕、干豆腐產(chǎn)量的遺傳變異系數(shù)分別為44%和35%，均較大，表明這四個(gè)不同球蛋白亞基組成材料的豆腐產(chǎn)量存在豐富的遺傳變異。其中由日A-5（α′-缺失型）制成豆腐的豆腐濕重最高，為156.14 g·50 g-1大豆，比對(duì)照高出35.89 g·50 g-1大豆。越南褐臍（β-極少型）的豆腐濕重最低，僅為48.50 g·50 g-1大豆。越南褐臍（β-極少型）材料的干豆腐重最低，為11.36 g·50 g-1大豆。由日A-5（α′-缺失型）制成豆腐的干豆腐重最高，為26.05 g·50 g-1大豆。由表3還可以看出，供試材料間的濕豆腐含水率、豆腐蛋白質(zhì)、蛋白保水率的差異不大。濕豆腐含水率（即豆腐保水性）是大豆蛋白凝膠的重要特性之一。供試材料間的濕豆腐含水率在76%～83%范圍波動(dòng)。日A-5、日B-1的濕豆腐含水率分別為83%和86%，均高于對(duì)照，而二者的蛋白保水率高出對(duì)照接近2倍。越南褐臍（β-極少型）的濕豆腐含水率和蛋白保水率最低，分別為76%和7.49 g·g-1。

2.3 不同大豆原料豆腐加工品質(zhì)性狀間的差異

由表4可知，不同7S、11S球蛋白亞基組成大豆的豆腐制品在豆?jié){蛋白率、濕豆渣重、干豆渣重和豆腐硬度上也存在顯著差異。豆?jié){是形成豆腐的最基本因素，豆?jié){蛋白濃度的大小對(duì)豆腐凝膠強(qiáng)度和持水率有顯著的影響，豆腐凝膠強(qiáng)度和持水能力不僅反映大豆蛋白的凝固狀態(tài)，還影響豆腐質(zhì)構(gòu)重建操作，從而決定最終豆腐產(chǎn)品的得率和外觀品質(zhì)。豆腐蛋白含量與豆腐凝膠硬度的相關(guān)系數(shù)為-0.0791，這可能是由于大豆豆腐凝膠強(qiáng)度主要是與大豆蛋白組分密切相關(guān)，而與豆腐蛋白總量相關(guān)性不大。越南褐臍（β-極少型）與日B-1[[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型]之間的豆?jié){蛋白濃度差異不顯著，但二者與日A-5（α′-缺失型）的豆?jié){蛋白率差異顯著（表4）。三者中日A-5（α′-缺失型）的豆?jié){蛋白率最高，為3.47%，比對(duì)照低0.16%。日B-1[[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型]的豆?jié){蛋白率最低，為3.03%，比對(duì)照低0.6%。

表3 不同大豆原料豆腐產(chǎn)量及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀的差異Table3 Variations of total yield and quality in soybean seeds of different varieties

表4 不同大豆原料豆腐加工品質(zhì)性狀的差異Table4 Variations of tofu processing characters in soybean seed of different varieties

供試材料間干豆渣重差異不顯著（9.05 g～9.88 g·50 g-1大豆），但是濕豆渣重差異顯著，其中日B-1[[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型]的濕豆渣重最高，為72.41 g·50 g-1大豆，比對(duì)照高出18 g·50 g-1大豆。三種不同亞基組成大豆材料的濕豆渣重均比對(duì)照高；其豆腐硬度也存在顯著差異，豆腐硬度最高的為越南褐臍（β-極少型），比對(duì)照高121.08 g。最低的為日B-1[[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-缺失型]，比對(duì)照低54.15 g，日A-5（α′-缺失型）的豆腐硬度，與對(duì)照差異不顯著，為136.99 g。綜合表3、4的結(jié)果可知，供試材料間不同加工性狀的變異程度不同，遺傳變異系數(shù)最大的是豆腐硬度為46%。豆?jié){蛋白率（8%）、濕豆腐含水率（8%）和干豆渣重（7%）的品種間變異系數(shù)比較相近，品種間豆腐蛋白含量和蛋白保水率變異系數(shù)均為26%。

2.4 不同大豆原料豆腐外觀品質(zhì)的差異

選取豆腐加工品質(zhì)指標(biāo)相對(duì)比較好的大豆原材料，比較其外觀品質(zhì)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出:由α′-亞基缺失型大豆日A-5制成的豆腐，成型較好、顏色呈淡白色，外觀品質(zhì)優(yōu)良。由東農(nóng)42制成的豆腐，成型也較好，但顏色微黃，外觀品質(zhì)不如日A-5的豆腐產(chǎn)品。而由[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-亞基缺失型大豆日B-1制成的豆腐，成型差、顏色呈乳黃色，外觀品質(zhì)差。

圖2 不同大豆原料加工出的豆腐產(chǎn)品Fig.2 Tofu productionmade from different soybeanmaterials

3 討論

豆腐是大豆蛋白凝膠食品，目前的研究結(jié)果普遍表明，不同大豆品種的蛋白含量與硫酸鈣豆腐得率之間不存在密切的相關(guān)關(guān)系，雖然兩者間的相關(guān)系數(shù)為正值，但未達(dá)到顯著水平[7,9,11-12]。即蛋白含量高的大豆未必能加工出得率高的豆腐。本研究供試大豆原料的蛋白質(zhì)含量范圍在44.90%～46.23%之間。其中，日B-1的蛋白質(zhì)含量為44.9%，比對(duì)照低1.95%，但其濕豆腐產(chǎn)量比對(duì)照高1.51%（表3）。Poysa與Mujoo等研究大豆蛋白質(zhì)含量與內(nèi)酯豆腐硬度的關(guān)系，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量（44%%～48.7%）與豆腐硬度極顯著正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量增加，豆腐硬度也隨之增加，蛋白質(zhì)含量越高，豆腐硬度越大[14,18]。由表2可知，供試品種中日A-5的大豆蛋白含量最高，其次是東農(nóng)42和日B-1，豆腐硬度最高是日A-5，最低為日B-1。以上結(jié)果符合前人報(bào)道的相關(guān)規(guī)律。

隨著大豆蛋白質(zhì)組分改良育種的發(fā)展，蛋白亞基組分含量對(duì)豆腐產(chǎn)量、品質(zhì)影響的研究日趨深入[17-18]，豆腐凝膠是由7S與11S兩種主要組分同時(shí)形成的，大豆蛋白質(zhì)組分對(duì)豆腐品質(zhì)的影響不是孤立的而是相互作用的，[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-亞基缺失型低7S含量種質(zhì)日B-1的蛋白質(zhì)含量為44.9%，但其豆腐硬度低（僅為77.07g），外觀品質(zhì)差，這與該材料在缺失（α′+α）-亞基的同時(shí)伴隨有11S球蛋白酸性亞基缺失（見(jiàn)圖1，第4泳道）有關(guān)，大豆11S球蛋白酸性亞基主要包含Ⅱa、Ⅱb亞基[6]，根據(jù)Yagaski等的報(bào)道，11S球蛋白的亞基組成在豆腐的成膠特性中起著至關(guān)重要的作用，11S球蛋白的Ⅱa亞基與成膠率和透明度密切相關(guān)，而Ⅱb亞基則與凝膠硬度相關(guān)[6]。因此，盡管日B-1的蛋白總量并未因7S球蛋白α′與α-亞基的缺失有所降低，但11S酸性亞基的缺失影響了該種質(zhì)的豆腐硬度。

大豆蛋白含量、蛋白質(zhì)組分含量與豆腐產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系是復(fù)雜的，關(guān)于大豆原料蛋白對(duì)豆腐得率和品質(zhì)影響的許多問(wèn)題還沒(méi)有完全明晰[13,15-18]，由于研究者在研究方法、研究標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)材料和試驗(yàn)條件等方面的差異，造成了研究結(jié)果的多樣性和不可比性。無(wú)論是豆腐加工工作者還是育種工作者，目前，尚不能根據(jù)某些理論指標(biāo)簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)大豆的豆腐加工品質(zhì)。另外，豆腐制作工藝復(fù)雜，影響豆腐品質(zhì)的因素很多，本研究以硫酸鈣為凝固劑，按傳統(tǒng)豆腐生產(chǎn)工藝進(jìn)行小樣本豆腐加工，結(jié)果表明:α′-亞基缺失型日A-5的大豆制成豆腐的豆腐濕重高出對(duì)照35.89 g·50 g-1大豆，干豆腐重與對(duì)照接近，濕豆腐含水率比對(duì)照高出7%，另外其豆腐硬度也比東農(nóng)42高，是供試材料中豆腐加工綜合商品性狀最好的材料。此大豆材料是否適用于其他豆腐工藝流程（如:以鹵水或葡萄糖酸內(nèi)酯為凝固劑），以及這一結(jié)果是否代表α′-亞基缺失型種質(zhì)的普遍特性，仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)，因?yàn)闇y(cè)定的品種太少，可能有偶然性。

以種質(zhì)資源在育種中的利用潛力為視角，各個(gè)品質(zhì)性狀的一些極端表現(xiàn)即極大、極小值是值得我們關(guān)注的。本研究的結(jié)果表明:越南褐臍（β-少型）大豆制得豆腐的硬度高達(dá)252.3 g，約是對(duì)照的2倍，豆腐硬度是其商品品質(zhì)的主要指標(biāo)，影響豆腐制品的成型、貯藏及運(yùn)輸，該種質(zhì)可在優(yōu)質(zhì)豆腐用品種親本選配中加以利用。

4 結(jié)論

大豆7S球蛋白亞基表現(xiàn)分別為:α′-亞基缺失，[（α′+α）+11S（Ⅱb+Ⅱa）]-亞基缺失和β-亞基極少型變異種質(zhì)日A-5、日B-1和越南褐臍的豆腐加工品質(zhì)間存在顯著差異，α′-亞基缺失型日A-5是適用于以硫酸鈣作為凝固劑加工豆腐的大豆種質(zhì)資源。低大豆7S球蛋白品系日B-1因同時(shí)伴隨有11S酸性亞基缺失，所制豆腐硬度低、成型差。越南引進(jìn)的越褐臍（β-少型）可在優(yōu)質(zhì)豆腐用品種親本選配中加以利用。

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