外源茉莉酸甲酯（MeJA）對大豆異黃酮合成途徑的影響

馬君蘭，趙 越

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

異黃酮是一種酚類次級代謝物，由苯丙烷類代謝途徑的一個分支合成。它主要是在豆科植物中合成，能夠誘導根瘤的形成。一些異黃酮化合物有抗真菌的活性，和/或者作為主要的植物抗毒素的前體，有的異黃酮本身就是植物抗毒素。近年來，異黃酮還成為了重要的保健品:能夠緩解更年期癥狀[1]；預防乳腺癌、前列腺癌等與激素有關的癌癥的發生[2]；預防心血管疾病[3]；對其他的一些生理學過程起到積極的影響，如神經生物學活動[4]。但是目前國內的研究大多關注于異黃酮的提取、純化和測定以及異黃酮的保健機理，無法從根本上解決異黃酮在自然界匱乏的問題。

植物進行光合作用形成碳水化合物后，通過磷酸戊糖途徑（PPP）途徑或EMP途徑都可以形成莽草酸。分支酸是芳香族氨基酸合成的分支點。分支酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸提供了碳架結構。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下形成肉桂酸，進入了次級代謝途徑。一些誘導物能夠調節植物的次級代謝，如:茉莉酸甲酯、水楊酸等。

茉莉酸類物質在植物中廣泛存在，并具有廣譜的生理效應、調控許多基因的表達。Creelman，Mullet指出，在植物抗病方面，主要是依靠茉莉酸甲酯對次級代謝產物的調節作用，尤其體現在對查爾酮合成酶（CHS）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的調節上[5]。茉莉酸甲酯（MeJA）處理可使兩者mRNA少量增加。乞永艷等報道了MeJA浸泡大豆的子葉能夠促進大豆異黃酮的增加[6]，但是隨著浸泡時間的延長，黃豆苷元、染料木黃酮的含量下降。本試驗利用茉莉酸甲酯對大田框栽的大豆進行葉面噴施，上調了大豆異黃酮的合成途徑，增加了大豆異黃酮的含量，初步分析了大豆種子成熟過程中，大豆異黃酮合成途徑的動態變化規律，為大豆異黃酮合成機理的研究搭建了平臺。茉莉酸甲酯有廣譜的生理功能并且無公害，利用它為誘導劑有一定的生產意義。

1 材料與方法

1.1 材料、取樣方法以及樣品制備

本試驗所用的材料是東北地區廣泛種植的品種東農47。從噴施后的第六天開始取樣，每隔5 d取一次樣，直至大豆籽粒成熟。上午8∶00～10∶00取樣。從大豆植株的上、中、下部以及每個平行處理中隨機取樣，混合后，測定各項指標，3次重復。濃度分別為75、150、300、450、600μmol·L-15個處理，在結莢期初期（8月4日）對大豆進行葉面噴施，早晚各一次，噴施3 d。

1.2 測定方法

1.2.1 PAL酶活性測定

粗酶提取:參照文獻[7]的方法并有所改進。取剪碎并混合后的樣品，按照1∶4的比例加入0.1 mol·L-1、pH 8.3、Tris-HCl緩沖液（內含 5 mmol·L-1巰基乙醇和0.5 g PVP）冰浴研磨；4℃10000 r·min-1離心15 min；棄沉淀，上清液為粗酶液。使用紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司UV-1600）進行酶活性測定:反應體系包括:0.5mL酶液、2mL緩沖液、1mL 0.02 mol·L-1的L-丙氨酸溶液、30℃水浴保溫30 min、290nm下測定吸光度。酶活力以△OD290nm=0.001為一個酶活力單位（U）。

1.2.2 色氨酸含量的測定

應用熒光分光光度計（美國PE公司）方法測定。色氨酸有2個激發光譜峰（225和280nm）和1個發射光譜峰（350nm），選用靈敏度高而干擾少的280nm作激發波長。激發光譜狹縫寬度為10nm，發射光譜狹縫寬度為10nm。將樣品殺青、烘干至恒重、粉碎、過篩、脫脂，脫葉綠素。堿法水解蛋白，將水解物轉移至已加有1.4mL 6 mol·L-1HCl的25mL容量瓶中；用pH 10.5的KH2PO4-NaOH緩沖液調節pH并定容；將樣品液過0.45 nm的膜，上機進行檢測。

1.2.3 總異黃酮含量的測定

改進文獻[8]的測定方法，應用紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司UV-1600）。總異黃酮標樣由東北農業大學生命科學學院郝再彬老師惠贈。將樣品殺青、烘干至恒重、粉碎、過篩、脫脂，脫葉綠素；60℃烘干至恒重，按照物料比為1∶6的比例加入80%的乙醇，50℃超聲波浸提1 h，冷卻至室溫；4000 r·min-1離心10 min，適當稀釋，260nm下測定吸光度，大豆異黃酮得率（μg·g-1）=提取液中大豆異黃酮質量（μg）/所用脫脂豆粉質量（g）。

1.2.4 黃豆苷元、染料木黃酮含量的測定

應用高效液相色譜儀（Agilent 1100 series）測定染料木黃酮和黃豆苷元。染料木黃酮與黃豆苷元的標樣由東北農業大學食品學院惠贈（Sigma公司，色譜純）。取所提取的總異黃酮溶液390μL（提取過程見1.3.3）定容至1mL；過0.45μm的抗有機溶劑膜；根據苗虹的測定方法[7]并進行改進。用進樣針吸入30μL（有20μL定量環）用高效液相色譜測定，高效液相色譜的條件:

流動相:甲醇∶磷酸（0.4%）6∶4；流速0.7mL·min-1；柱溫30℃；檢測器（紫外）；波長260nm；進樣量20μL。

黃豆苷元或染料木黃酮得率（μg·g-1）=提取液中黃豆苷元或染料木黃酮的質量（μg）/所用脫脂豆粉質量（g）。

2 結果與分析

2.1 MeJA對大豆籽粒PAL活力的影響

結果見圖 1。在 0～450μmol·L-1濃度范圍內，籽粒PAL活力隨著MeJA噴施濃度的增加而增加，但600μmol·L-1的處理PAL 活力與 450μmol·L-1的處理相比，時高時低。說明外源茉莉酸甲酯誘導PAL的酶活性，進而對次級代謝途徑產生影響。在整個結莢期籽粒PAL活呈現低-高-低的拋物線趨勢。PAL的活力不僅表現對次級代謝途徑的動態變化還是植物抗逆的重要指標。茉莉酸甲酯對PAL的誘導作用也表明它能夠提高植物的抗逆性。

圖1 MeJA對大豆籽粒PAL活力的影響Fig.1 Effect of exogenous MeJA on the activity of PAL in seed

2.2 MeJA對籽粒色氨酸合成的影響

結果見圖2。

MeJA能夠促進色氨酸的合成，450和600μmol·L-1處理后的色氨酸含量較高。450μmol·L-1處理后種子色氨酸含量為4160μg·g-1，比對照高了1120μg·g-1。MeJA在誘導植物防御的胞內信號轉導的途徑中起整合作用，能夠增強植物的己糖-磷酸（HMP）途徑，產生低分子質量的酚類前體，可能是由于MeJA所產生的這些低分子量的酚類前體物被色氨酸合成途徑所利用，使色氨酸的含量增加。從種子開始發育到成熟，色氨酸含量的變化趨勢是從低到高的，說明在植物生殖生長時期，主要是進行的色氨酸的合成反應，并能通過將其與其它氨基酸縮合形成蛋白的形式，將色氨酸積累在種子當中。

圖2 MeJA對籽粒色氨酸含量的影響Fig.2 Effect of exogenous MeJA on the tryptophan level in seed

2.3 MeJA對大豆異黃酮合成的影響

結果見圖3～5。

圖3 MeJA對籽粒黃豆苷元合成的影響Fig.3 Effect of exogenous MeJA on the synthesis of daidzein in seed

圖4 MeJA對籽粒染料木黃酮含量的影響Fig.4 Effect of exogenous MeJA on the genistein level in seed

圖5 MeJA對籽粒總異黃酮含量的影響Fig.5 Effect of exogenous MeJA on the isoflavone level in seed

異黃酮含量隨著噴施濃度的增大而增大，但是600μmol·L-1的處理與450μmol·L-1的處理相比，異黃酮的含量并沒有顯著的提高。這是由于:首先MeJA能增強植物產生低分子質量的酚類前體以及在多聚作用時產生游離基；其次，MeJA能促進PAL活力，從而上調次級代謝途徑。MeJA所產生的低分子質量酚類前體和上調次級代謝途徑共同作用促進異黃酮合成的中間產物增加，并促進異黃酮的合成。450μmol·L-1的茉莉酸甲酯處理后所收獲的大豆種子中黃豆苷元的含量比對照提高了5.1μg·g-1，染料木黃酮的含量比對照提高了5.1μg·g-1，總異黃酮的含量比對照提高了960μg·g-1。在大豆生殖生長的過程中，黃豆苷元，染料木黃酮含量的變化趨勢與總異黃酮的含量的變化趨勢不同:黃豆苷元與染料木黃酮呈由低-高-低-上升的趨勢，總異黃酮呈低-高的變化趨勢。這可能是由于黃豆苷元和染料木黃酮還要作為下游的異黃酮類化合物的前體物質，如:游離的黃豆苷元和染料木黃酮在糖基轉移酶的作用下，逐漸轉化成糖苷型；黃豆苷元是異戊烯黃酮（Glyceollins）的前體[6]。在種子成熟前的14 d，染料木黃酮和黃豆苷元的量又有逐漸升高，這可能是由于種子即將成熟，各種合成酶和糖基轉移酶失活和水解，又將少量染料木苷水解為染料木黃酮。總異黃酮呈低-高的變化趨勢，說明種子發育的階段主要進行的是異黃酮的合成和積累反應。

相關性分析表明在種子發育的初期到中后期，籽粒的PAL活力與黃豆苷元和染料木黃酮的合成呈顯著正相關，甚至在某些時期出現極顯著水平。但是在種子成熟的前14 d，PAL活性檢測不到的時候，黃豆苷元和染料木黃酮的含量又呈上升趨勢，說明在種子發育的初期和中后期，籽粒中的PAL是黃豆苷元和染料木黃酮的限速酶。總異黃酮成分復雜，影響其含量的酶和因素較多。PAL活力上升時，總異黃酮含量也在上升，但是在種子PAL活力降低的時候，總異黃酮的含量還在增加。可能是異黃酮比起PAL來有一個積累的過程和相對的滯后期。PAL可能不是總異黃酮的限速酶，其原因有待進一步分析和研究。

色氨酸與大豆異黃酮的合成的關系還未見報道。相關性分析表明色氨酸和總異黃酮合成的趨勢極顯著的相關說明充足的前體物質為色氨酸和異黃酮得合成提供了充足的碳架結構。

3 討 論

利用誘導子刺激植物細胞生產次生代謝產物己成為目前國內外研究的常用手段，但對于誘導子調節植物細胞的初生代謝物和次生代謝物的合成的研究較少。MeJA能夠誘導植物防御的細胞內信號轉導途徑[9]從而誘導了植物次級代謝的途徑，包括植物次級代謝途徑的相關酶類，PAL，CHS等，以及黃酮類，異黃酮類及生物堿類物質的合成[10]。

色氨酸、黃豆苷元、染料木黃酮以及總異黃酮都屬于酚類次級代謝產物。MeJA促進它們大量合成的機理可能在于MeJA能增強植物的HMP途徑，誘導初生代謝使前體物增加，一方面促進植物葉片纖維素及木質素含量的升高；另一方面，又能產生低分子量的酚類前體以及在多聚作用時產生游離的基團。黃豆苷元、染料木黃酮的增加還由于PAL的活力增強的因素。造成本試驗與報道不相同的結論的原因可能是所處理的大豆的條件不一樣。本試驗處理的是活體的大豆植株。

本試驗研究表明:MeJA能夠上調大豆異黃酮的合成途徑—提高了種子當中的色氨酸、黃豆苷元、染料木黃酮以及總異黃酮的含量。本試驗在大豆生殖生長階段，對大豆異黃酮代謝途徑各物質的代謝的動態變化進行研究，其中對色氨酸、黃豆苷元和染料木黃酮的動態變化的研究國內外還未見報道。了解整個種子生殖生長時期，對異黃酮代謝機理的研究有助于我們從分子水平和化學、物理多種因素對異黃酮的合成途徑進行調控從而達到增加黃豆苷元和染料木黃酮的含量的目的并且也有利于我們有目的地選擇采摘的時間和對大豆品質進行改良。杜邦公司將CRC轉錄因子導入大豆中，從而提高了PAL mRNA含量，從而上調了整個大豆異黃酮的代謝途徑，成功的提高大豆異黃酮的含量，培育出擁有自己產權的新品種[11]。

4 結論

a.茉莉酸甲酯能夠上調大豆異黃酮的代謝途徑，450μmol·L-1的茉莉酸甲酯是噴施最適濃度。

b.在大豆的整個生殖生長時期，色氨酸呈現由低到高的的拋物線趨勢，大豆總異黃酮的積累隨著色氨酸的增加而增加，但黃豆苷元、染料木黃酮的合成與色氨酸的合成相關性不顯著。

c.在大豆的整個生殖生長時期，黃豆苷元、染料木黃酮呈由低-高-低-上升的動態變化，總異黃酮含量呈由低到高的拋物線趨勢。黃豆苷元、染料木黃酮與總異黃酮的合成的相關性不顯著。

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