超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白研究

王喜波，遲玉杰,2*，胥 偉

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

超聲處理技術在食品加工領域已有應用，如食品體系的乳化、殺菌、破碎、萃取功能成分、干燥、檢測等[1-5]。近幾年來，隨著各種不同型號超聲設備的研制和完善，超聲處理技術已漸成為食品工業中研究與開發的重點新型技術之一[6]。利用超聲技術處理乳清蛋白的研究報道較多[7-9]，如改善和提高乳清蛋白的溶解性、起泡性等，但是關于超聲輔助琥珀酰化處理大豆蛋白以提高其功能性質的影響研究很少。

大豆蛋白具有較高的營養價值和重要的功能性質[10-13]，因而在食品工業中有廣泛的應用。但是天然大豆蛋白的功能性質較差，無法滿足食品加工的需求，必須對其進行適度的改性[14-15]。蛋白質改性的方法很多，如物理、化學、生物酶等方法[16-18]，目前這些改性方法多數處于研究階段，較少用于實際生產。酰化改性是提高大豆蛋白功能性質的有效化學改性方法[19-20]，改性產物的溶解性、乳化性都有一定程度的增加[21]，但采用超聲輔助酰化改性技術提高大豆蛋白功能性質鮮有報道。

本文將物理改性與化學改性技術相結合，利用超聲技術輔助琥珀酰化改性大豆蛋白新工藝，研究優化改性條件、建立影響大豆蛋白乳化性因素間數學模型、探索改性前后蛋白分子特點變化，為建立適宜生產推廣的高乳化型大豆蛋白改性新技術提供技術和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

大豆蛋白（蛋白含量85%）:哈高科大豆食品有限責任公司；大豆油:北海糧油工業（天津）有限公司；琥珀酸酐:國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）為化學純；其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設備

噴霧干燥機（BüChi Spray Dryer（瑞士））；2501 PC紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；FS-1可調高速勻漿機（金壇市榮華儀器制造有限公司）；LD4-2A型離心機（北京醫用離心機廠）；JY92-2D超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；F-4500熒光分光光度計（日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 普通琥珀酰化改性大豆蛋白工藝

將大豆蛋白（Soybean proteins，SP）溶于蒸餾水中按試驗設計配成一定濃度，調整溶液pH 8.0，將琥珀酸酐（Succinic anhydride，SCA）試劑三等分，分別間隔5 min加入蛋白溶液中，反應一定時間，反應過程用2 mol·L-1NaOH維持反應體系的pH在8.0～8.5范圍，反應結束后，溶液pH調至4.0，攪拌 30 min，4000 r·min-1離心 15 min，棄上清液，沉淀部分重復離心水洗2次，調pH至7.0，冷凍干燥即得普通改性產物。

1.2.2 超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白

將大豆蛋白溶于蒸餾水中按試驗設計配成一定濃度，取60mL于燒杯中，置于探頭式超聲處理器中，按試驗設計設定工作時間、間歇時間、處理功率參數，處理溫度控制在20～30℃，處理結束后，按普通琥珀酰化改性步驟執行。

1.2.3 乳化性測定

將0.2%（W/V）的大豆蛋白樣品溶解于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，0.1 mol·L-1）中，取30mL溶液加入10mL大豆油，于10000 r·min-1均質1 min，分別在均質后的0、10 min時從底部吸取100μL樣品，用10mL，0.1%（W/V）的SDS稀釋后在500nm（OD500）下測定吸光值，乳化活性用乳化活性指數（EAI）表示，即0 min時的吸光值，乳化穩定性用乳化穩定指數（ESI）表示[22]:

式中，A0-0 min時的吸光值；ΔT-時間差，10 min；ΔA-ΔT內的吸光值差。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

采用不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[23]分析大豆蛋白改性前后的組成和結構的變化。

1.2.4.1 樣品處理

精確稱取0.01 g的樣品，溶于10mL去離子水中，在4000 r·min-1離心20 min，取上清液10μL加入10μL溶解液中，在沸水浴中加熱3 min。

1.2.4.2 灌膠和電泳過程

使用夾心式垂直板狀電泳槽，玻璃板參數為20 cm×20 cm，使用的濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為12%，凝膠厚度1 mm，上樣量為10μL。電泳初始時電流30ma，待蛋白樣品進入分離膠時電流增到40ma；當溴酚藍指示劑遷移到凝膠板底部時，電泳結束。

1.2.4.3 染色與脫色

剝離凝膠，加入甲醇-乙酸固定液（甲醇∶水∶乙酸=5∶5∶1，V/V）固定過夜。取出固定好的凝膠在染色液（含0.05%考馬斯亮藍R250的固定液）中染色1～2 h，棄去染色液，加入脫色液（甲醇∶冰乙酸∶水=2∶2∶9，V/V），經常更換脫色液，直至凝膠的藍色背景褪除，蛋白條帶清晰為止。在凝膠置于凝膠成像系統中分析。

1.2.5 熒光光譜分析

樣品溶于磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol·L-1、pH 7.0）中，配制1%蛋白液，裝入1 cm石英比色皿，置于F-4500熒光分光光度計中測量，激發狹縫和發射的狹縫均為5.0nm，激發波長為280nm，發射波長的范圍為300～420nm。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白工藝優化

結果見表1，2。

本文在預實驗結果基礎上，以乳化活性為考核指標，應用響應面研究法（Response surface methodology，RSM）對影響改性產物EAI的大豆蛋白濃度、琥珀酸酐濃度、反應溫度、超聲處理功率、處理時間等5個因素進行優化，設計了Boxbehnken試驗方案，建立數學模型。Box-behnken試驗因素水平編碼表見表1，Box-behnken試驗方案和結果見表2。

表1 Box-behnken試驗因素水平編碼Table1 Factors and levels of Box-behnken experiment design

表2 Box-behnken試驗條件及結果Table2 Box-behnken design and results of experiment

利用Design-Expert 7.1軟件對表2的試驗結果進行二次回歸擬合分析，得到超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化活性Y的回歸方程模型為:

對Box-behnken試驗結果進行方差分析，分析結果見表3。由表3的方差分析結果可知，所得回歸方程模型極顯著（P＜0.01），并且模型的失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），說明用方程Y能夠很好擬合真實響應面并反映出乳化活性與5個單因素之間的關系，可以利用此模型對超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的反應過程進行預測和分析。根據表3的方差分析對Box-behnken模型方程進行優化，剔除影響不顯著項（P＜0.05），得到優化后的回歸模型為:

表3 Box-behnken試驗方差分析Table3 Variance analysis of Box-behnken design test

為了形象直觀的表示各個因素對改性產物乳化活性的影響，根據模型繪制出因素間響應面圖，揭示因素間的交互作用對產物乳化活性的影響，結果如圖1所示。

由圖1-a、1-b、1-c、1-d可知，大豆蛋白濃度對改性產物EAI的影響曲線較平緩，最佳反應條件集中在中心區，模型分析也表明蛋白濃度對改性產物的EAI影響不顯著（P＞0.05）。

圖1 影響乳化活性因素的響應面分析Fig.1 Effects of variables on EAI with response surface analysis

由圖1-a、1-e、1-f、1-g可以看出，改性產物的EAI隨著琥珀酸酐濃度增加而呈上升趨勢，但當琥珀酸酐濃度超過11%時，改性產物的EAI增加趨勢不明顯，表明此時大豆蛋白能發生酰化反應的活性基團已經反應完全，模型分析表明琥珀酸酐濃度對產物EAI影響極顯著（P＜0.01）；由圖1-b、圖1-e、圖1-h、圖1-i能看出，反應溫度對產物EAI影響顯著（P＜0.05），反應溫度在50℃左右，改性產物EAI達到最高，高于或者低于此溫度，EAI均下降；從圖1-c、圖1-f、圖1-h、圖1-j和模型方差分析中反映出，超聲處理功率對產物EAI的影響極顯著（P＜0.01），在600 W左右產物EAI達到最高值，表明超聲處理可以使大豆蛋白較緊密的結構舒展開[23]，功率太高可能破壞已經形成蛋白聚集體使產物EAI降低，而處理功率不足時，蛋白緊密的球狀結構不能充分伸展，疏水基團不能充分暴露，因而產物EAI也不高；從圖1-d、圖1-g、圖1-i、圖1-j可知，超聲處理時間對產物EAI的影響，當處理時間為8 min左右時，產物EAI達到最高值，再繼續增加處理時間則產物EAI有下降趨勢。

2.2 驗證試驗

根據Box-behnken試驗模型優化反應條件，得出超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的制備條件為:大豆蛋白濃度7.1%，琥珀酸酐濃度12%，反應溫度51℃，超聲功率580 W，處理時間8 min，在此條件下模型EAI理論預測值（OD500）為0.825，實際測得值為0.819，實際值與預測值之間的相對誤差在±1%以內，說明利用響應面分析法優化得到的工藝參數可靠準確，依據模型對改性產物EAI進行預測在實際試驗中具有可行性。根據優化的工藝條件進行驗證試驗，并對比不同處理條件下個樣品的乳化特性，如圖2所示。

圖2 改性產物與未改性樣品EAI和ESI比較Fig.2 Comparison of EAI and ESI of modified and non-modified soybean proteins

結果表明，單一使用超聲波處理或琥珀酰化可以使改性產物的乳化活性和穩定性明顯提高（2號樣品和3號樣品），而超聲輔助琥珀酰化改性產物的EAI和ESI（4號樣品）要優于前兩種單一方法，說明4號樣品的EAI和ESI大幅提高是物理超聲波作用和琥珀酰化化協同作用的結果，其EAI和ESI比空白樣品分別提高了94.5%和268.9%，因此試驗研究可為實現工業化生產高乳化型大豆蛋白產品提供理論和技術參考。

2.3 SDS-PAGE電泳分析

本文對改性前后的大豆蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖3所示。經超聲改性的大豆蛋白的電泳譜帶與未改性大豆蛋白的譜帶幾乎完全相同，說明超聲作用只改變了大豆蛋白的高級結構，而對大豆蛋白的一、二級結構無明顯影響，與Taylar等的研究結果一致[24]，因此超聲改性大豆蛋白乳化性的提高不是因為蛋白分子量降低造成的。經琥珀酰化和超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的電泳遷移率略小于未改性的大豆蛋白，說明琥珀酸酐基團成功引入并使大豆蛋白分子發生了一定的聚集，從而使得大豆蛋白分子質量增大。而在譜帶的構成上，與未改性的大豆蛋白相比變化不大，說明在改性的過程中大豆蛋白幾乎不發生水解反應，乳化性的提高是酰化反應引入琥珀酸酐基團的作用。樣品3和樣品4的譜帶顏色相對較淺，一方面是由于酰化改性使得大豆蛋白溶解性提高，在離心除鹽時有少量大豆蛋白隨上清液除去，另一方面是離心未除凈的少量鹽類物質使反應產物中的蛋白含量降低。

圖3 改性前后大豆蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of modified or unmodified SP

2.4 熒光光譜分析

熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強，方法簡便等優點，可用于研究溶液中的蛋白質的構象。在蛋白質分子中，能發射熒光的氨基酸只有Trp、Tyr、Phe，其熒光峰位（λmax）分別是348、303及282 nm，其中Trp的熒光強度最大，Phe的熒光強度最小。蛋白質熒光通常在280nm或更長的波長被激發，此條件下Phe基本不被激發，所以很少能觀察到Phe的熒光發射，蛋白質的內源熒光主要來自Trp和Tyr殘基。本試驗將改性前后的樣品進行熒光光譜比較分析，結果見圖4。

圖4 四種大豆蛋白樣品的熒光發射圖譜Fig.4 Fluorescence emission spectrums of four soybean proteins samples

大豆蛋白經改性后，熒光吸收強度均增加。Trp殘基對微環境的變化很敏感，常被作為內源熒光探針來研究溶液狀態蛋白質的構象，其λmax一般在325～350nm波長范圍內波動[25]。由圖4可知，不同改性方法對其熒光光譜影響程度有所不同，琥珀酰化和超聲輔助琥珀酰化改性對的光譜的影響最大，熒光強度增加，說明Trp殘基所處環境疏水性發生變化，反映出蛋白分子結構變化。天然大豆蛋白的結構為緊密的球狀結構，親水基團在外，疏水基團在內，呈色基團絕大部分位于分子內部，因此λmax處于較低水平，經過超聲處理和琥珀酰化改性的大豆蛋白結構伸展，使內部的呈色基團暴露出來，使Trp的發射波長紅移。從圖中可看出超聲改性對。λmax值的影響較小，說明試驗條件下的超聲處理對大豆蛋白的呈色基團所處的環境影響較小，即對疏水核心破壞較小。琥珀酰化和超聲輔助琥珀酰化改性對λmax值的影響較大，說明兩種改性方法使得大豆蛋白的結構更加舒展，但兩種大豆蛋白熒光曲線幾近重合，說明兩種改性方法對大豆蛋白空間結構的影響及對疏水核心的破壞程度相近。

3 討論

大豆蛋白的改性研究一直是食品研究熱點之一，尋求技術可行、效果良好、安全性高的改性方法是本領域的研究重點。超聲波技術在食品加工中用來提高生產效率和產品質量，取得了令人滿意的結果，經超聲處理的乳清蛋白，其起泡性等功能特性明顯提高[7-9]，大豆蛋白的表面性質也有提高[21]。本文的預實驗結果表明探頭式超聲波處理器對大豆蛋白改性效果好于槽式處理器，與已有報道相符[26]。琥珀酰化改性大豆蛋白在提高蛋白溶解性、乳化性等方面具有明顯效果[19-21]。但是單一的物理或化學改性，大豆蛋白的乳化特性提高幅度有限或者受到制備條件制約，將超聲技術與琥珀酰化改性相結合進一步提高改性蛋白的乳化特性是本文的研究重點，結果表明，采用超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化特性優于單一方法[19-20,23]，具有較好的發展潛力。目前的研究趨勢表明，復合改性技術成為蛋白改性領域的研究熱點和重點，因為復合改性具有效果明顯、安全性高、成本較低等優點。

4 結論

a.超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化性質優于單一的超聲改性或琥珀酰化改性方法，說明超聲輔助琥珀酰化改性技術是超聲的物理作用和琥珀酰化的化學作用協同作用的結果，是提高大豆蛋白乳化性質的有效方法。

b.SDS-PAGE電泳、熒光光譜分析結果表明，超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白產物結構發生較復雜的變化，更有利于乳化體系的形成和穩定。

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