應用PCR方法向基因內部引入序列的策略研究

徐亞英，王 勇，羅 宏，陳 典

（東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030）

基因定位突變是指將某一克隆基因按預先設計好的目標進行定點改造，它僅適用于基因序列已知，蛋白結構與功能的關系比較明確的基因[1]。由于它具有簡單易行、重復性高等優點，現已發展成為基因操作的一種基本技術[2]。常見體外定點突變的方法有化學誘變、寡核苷酸介導的誘變、盒式誘變和基于PCR方法的誘變等[3]，其中基于PCR方法的誘變以其簡單、快速的優勢逐漸成為DNA體外修飾產生新型蛋白質的最常用方法[4]。

Cre重組酶來源于P1噬菌體[5]，它不僅具有催化活性，而且同限制酶相似，可以識別特異的DNA序列并進行特定的剪切和拼接[6-7]。當其作用序列位點—兩個34bp的loxP位點存在時，它可根據loxP位點的方向不同發生倒位、移位和刪除反應[8-9]。Cre/1oxP已廣泛應用于內、外源基因失活或敲除、基因激活等反應[10-11]。目前，Cre/1oxP定位重組系統在應用中存在兩個主要問題:Cre重組酶的刪除效率較低，其刪除效率僅為50%左右[12]；此前，在我們實驗室的研究工作中發現，當Cre重組酶與loxP位點共存于一個寄主細胞中時，常由于Cre重組酶的痕量表達而引起loxP位點間序列的非目的性刪除。針對以上缺陷，本試驗設計了3條引物，利用PCR方法向cre基因內部引入一段具有增強基因在真核生物中表達效率的內含子序列（pfu1305.1）[13]，以改變其在原核細胞中的通讀序列，完成cre基因的改造，進而達到提高Cre/1oxP定位重組系統在轉基因真核生物中的刪除效率的目的同時，也避免了cre基因的滲露表達。為了使cre基因的突變達到最佳效果，本試驗設計了三種PCR策略，并對每種策略進行了體系優化，以確定基因改造的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒

pMM23、pCAMBIA1305.1均為本實驗室保存，其中pMM23含有Cre序列（1029bp），pCAMBIA1305.1含有需插入到Cre中的內含子序列（AF354045.1，190bp）。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶（附帶Buffer及Mg2+）、dNTPs（購自上海生工）；DNAmarker（DL2000，購自寶泰克）。

1.1.3 PCR引物序列

依據Cre（X03453.1）和intron（AF354045.1）的序列，設計了如下三條引物用于cre基因的改造，所有引物均由上海生工合成（見表1）。配成100 mmol·L-1的儲存液并稀釋成10 mmol·L-1備用。

1.2 方法

利用三種PCR策略對cre基因進行突變的反應體系、條件及檢測。

1.2.1 一步PCR策略

將三條引物08crein1、crein2、cre3與兩個模板pCAMBIA1305.1、pMM23加入同一反應體系中，20μL擴增體系中包括:10×PCR buffer 2.0μL；dNTPs（10 mmol·L-1）0.4μL；08crein1（10 mmol·L-1），cre3（10 mmol·L-1） 各 1μL； pMM23（20 ng·μL-1）0.6μL；然后分別對Mg2+、中間引物crein2、內含子擴增模板pCAMBIA1305.1、Pfu進行了不同濃度的單因素體系優化試驗；Mg2+（25 mmol·L-1）濃度設置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；crein2（1 mmol·L-1），0.1、0.2、0.5、0.8、1μL；pCAMBIA1305.1 （20 ng·μL-1），0.06、0.12、0.5μL；Pfu（2.5 U·μL-1），0.2、0.4、0.6μL；加ddH2O補足20μL。當就某一成分進行體系優化時，其他成分取中間值。擴增條件:94℃，7 min；30個循環（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）；72℃，7 min。

擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE，保持100 V恒壓（4～5 V·cm-1），電泳30 min，紫外燈下檢測擴增結果。

表1 cre基因改造的引物Table1 Primers of cre gene transformation

1.2.2 二步PCR策略

利用PCR方法分兩步對cre基因進行突變。

①Intron的擴增

20μL擴增體系中包括:10×PCR buffer，2.0μL； MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL； 08crein1（10 mmol·L-1）、crein2（10 mmol·L-1）各 1μL； pCAMBIA1305.1（100 ng·μL-1），0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1），0.2μL；加ddH2O補足20μL。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，7 min。

電泳分析操作同上，擴增得到的目的片段約為220bp（內含子加兩端引物的長度），命名為Pfu1305.1，此步PCR產物作為下一步反應引物。

②crein的擴增:以pMM23為模板，以Pfu 1305.1、08crein1、cre3為引物進行擴增反應。

20μL 擴增體系中包括:10×PCR buffer 2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1）0.2μL； 08crein1（10 mmol·L-1）；cre3（10 mmol·L-1）各 1μL；pMM23（20 ng·μL-1）0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1）0.2μL；然后分別對Mg2+、單引物Pfu1305.1進行了不同濃度的單因素體系優化試驗；Mg2+（25 mmol·L-1）濃度設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL；Pfu1305.1（20 ng·μL-1），0.2、0.5、0.8μL；加ddH2O補足20μL。當就某一成分進行體系優化時，其他成分取中間值。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）；72℃，7 min。電泳分析操作同上。

1.2.3 三步PCR策略:

①同1.2.2中的①；

②以pMM23為模板，以Pfu1305.1為引物對cre基因進行單引物擴增；

20μL 擴增體系中包括:10×PCR buffer，2.0μL； MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL； Pfu1305.1（20 ng·μL-1），0.5μL；pMM23（20 ng·μL-1），0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1)，0.2μL；加ddH2O補足20μL。

擴增條件如下:94℃，7 min；5 or 10 or 15 or 20（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）

③取1μL上述擴增產物（crein基因）為模板，以08crein1、cre3為引物對插入內含子序列的cre基因進行PCR擴增。

20μL 擴增體系成分如下:10×PCR buffer，2.0μL；MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL；dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL；08crein1（10 mmol·L-1）、cre3（10 mmol·L-1）各1μL；crein，0.2μL； Pfu（2.5 U·μL-1），0.2μL；加ddH2O補足。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環（94℃，20 s；56℃，30 s；72℃，1 min）；72℃，7 min。電泳分析操作同上。

2 結果與分析

2.1 一步PCR策略

將三條引物08crein1、crein2、cre3與兩個模板pCAMBIA1305.1、pMM23加入同一反應體系中進行基因擴增，結果見圖1。

圖1 一步PCR策略基因擴增結果Fig.1 Amplification result of the gene by one-step PCR

不同模板比例、不同酶加入量、不同中間引物濃度、不同Mg2+濃度下的部分擴增結果見圖1。如前文所述，改造后的crein基因大小應為1200bp左右，但圖中顯示，對不同因素進行優化，在1200bp處都無可見條帶，而在270bp處有較暗雜帶產生，說明利用三引物兩模板的一步PCR策略，即便是對PCR反應體系進行優化，也難以擴增出目的條帶。

2.2 兩步PCR策略

2.2.1 內含子的擴增

以pCAMBIA1305.1為模板、08crein1和crein2為引物進行內含子的擴增結果如圖2所示，在220bp處有較亮的目的條帶，且不存在非特異擴增。此步特異擴增效率高，故不必對體系進行優化。

2.2.2 crein的擴增

此步反應是以pMM23為模板，以Pfu1305.1、08crein1、cre3為引物進行目的條帶的擴增。如圖3所示，不同的Mg2+加入量和不同的Pfu1305.1濃度條件下均在1200bp處擴增出了較亮的目的條帶，也均在約270與2500bp處有較暗的雜帶產生，且不同體系條件下擴增結果基本一致。結果表明，應用兩步PCR策略可以完成基因的改造，但存在非特異擴增（此步2500bp處的非特異條帶不明顯）。

圖2 Intron的擴增結果Fig.2 Amplification results of the intron

圖3 不同條件下crein基因的擴增結果Fig.3 Amplification results of crein gene under different conditions

2.3 三步PCR策略

2.3.1 內含子的擴增

結果同2.2.1。

2.3.2 單引物擴增

此步驟是以pMM23為模板，以Pfu1305.1為引物對cre基因進行單引物擴增，以增大crein基因數量，并將其作為下步PCR反應的模板。在試驗中，對PCR擴增的循環數進行了梯度設置，即分別為5、10、15、20個循環。設置循環的目的在于探討單引物擴增循環數的不同是否會對下步crein基因序列的擴增產生影響。由于此步為單引物循環，循環數又較少，故凝膠電泳未顯示出目的條帶，如圖4所示。

圖4 crein基因的單引物擴增Fig.4 Amplification results of crein gene using a single primer

2.3.3 crein基因的擴增

結果見圖5。

圖5 crein基因的三步擴增結果Fig.5 Amplification results of crein gene using three-step PCR

分別各取上述不同循環的PCR產物1μL為模板，以08crein1、cre3為引物進行PCR擴增。結果如圖5所示，當分別采用5、10、15、20個循環數進行模板擴增后，在酶用量分別為0.2和0.4μL條件下，都擴增出了明亮而特異的1200bp左右的目的條帶。說明，單引物擴增后產生的微量產物可以作為本步擴增的模板，擴增結果并不因循環數的不同而產生明顯差異。當DNA聚合酶的用量分別為0.2、0.4μL時，擴增條帶的亮度也沒有明顯差異。為了減少前一步PCR過程對此步驟的影響，前一步單引物擴增循環數可取最小值，即5。

3 討論

3.1 不同PCR策略的優劣分析

基因突變技術是蛋白質工程中應用的重要技術之一，包括單個堿基或整段序列的替換、基因片段的插入與刪除等類型，可以有目的改變DNA序列中的堿基，使之滿足不同的研究和應用需求[14]。近幾年來,以PCR為基礎的定點誘變方法得到不斷的創新和改進，使得定點誘變越來越省時省力，簡單易行，倍受研究者青睞[15]。而在本試驗中，針對三種PCR策略進行比較分析，以確定基因改造的最佳方法，其優劣分析如下:

一步PCR策略的優點是整個基因改造過程只需一步即可完成，方便快捷，但在其反應體系中成分復雜，共有兩個模板與三個引物，幾個PCR反應同時進行，且相互間互相干擾，雖然我們就反應各組成體系及反應條件都進行了摸索與優化，但都沒有得到理想結果。因此，一步PCR策略對反應條件和體系的要求較為苛刻，目的基因的擴增具有一定的難度；相對于一步PCR策略，二步PCR策略是先獨立擴增出了用于基因突變的引物，然后再將其加入體系中，進行改造后基因的擴增。此種策略減少了一定量的基因擴增的干擾因素，但把單引物擴增和雙引物擴增放在一個體系中進行，反應過程仍存在其他的干擾，因此，雖能擴增出較清晰的目的條帶，但存在著較多的非目的條帶擴增；而三步PCR策略分解了整個基因改造的全過程，相當于把每一步反應都獨立出來，即將體系間的相互干擾降到最小。雖然其擴增步驟為三步，相對較為繁瑣，但由于每一步反應都是比較簡單，基本上不必進行任何體系的摸索與優化，就可以直接獲得特異、明晰的目的條帶，且反應條件較為寬泛，易于進行目的基因的擴增。因此，可認為三步PCR策略是三種基因改造策略中最實用的策略。其基因改造的路線如圖6所示。

圖6 利用三步PCR策略進行基因改造的路線Fig.6 Schematic diagram of three-step PCR approach for improving crein gene

3.2 三步PCR策略的引申

本試驗針對在基因5′端插入序列的情況進行了探討。當擬在基因中間部位插入序列時，可利用4個引物5步PCR的方法進行。第一步，雙引物擴增得到基因前半段；第二步，單引物擴增獲得含有插入序列的前半段基因；第三步，雙引物擴增以產生基因后半段的部分堿基；第四步，單引物擴增得到目的基因；第五步，雙引物擴增進行目的基因的累積。

4 結論

本研究以PCR方法在基因起始部位附近進行基因的突變或改造，最佳方法為三步PCR策略:首先是引物1與引物2引導的插入序列的擴增；其次是以擴增后所得序列為單引物進行的擴增，此步驟所得的產物可作為下步反應的模板；最后是以第二次PCR產物作為模板，以引物1和引物3所進行的改造后基因的指數擴增。

[1]趙和.生物技術在基因誘變中的應用[J].河北農業科學,2006,10(1):92-96.

[2]王秋穎.基因體外定點誘變技術[J].山西農業大學學報，2007,27(6):124-126.

[3]梁暉,李雪,孫紫陽.發生點突變的pCDNA3.1(+)質粒的構建[J].天津醫科大學學報,2008,14(3):374-382.

[4]李晶琴.基于PCR技術的蛋白質改造策略[J].國際檢驗醫學雜志,2006,27(12):1129-1131.

[5]Sternberg N,Sauer B,Hoess R,et al.Bacteriophage P1 cre gene and its regulatory region evidence for multiple promoters and for regulation by DNA methylation[J].Journal of Molecular Biology,1986,187:197-212.

[6]邱淑萍,陳在杰,王鋒.Cre/loxp位點特異性重組系統在轉基因植物中的應用[J].福建農業學報,2008,23(2):211-217.

[7]李文旭.基于Cre lox P系統誘導刪除抗生素基因植物表達載體的構建[D].福州:福建農林大學,2009.

[8]李大旭,馬靜云,曹永長.Cre lox P重組系統的特點及其在抗體研究中的應用[J].生物技術通報,2008(1):56-57.

[9]王文棋,蓋穎,陸海,等.DNA重組酶Cre介導載體間基因的重組轉移[J].生物化學與生物物理進展,2007,34(11):1210-1215.

[10]任榮榮,王英偉.Cre/lox p系統的應用及進展[J].廣州醫學院學報,2008,36(2):78-80.

[11]陳雙喜,許守明.Cre/lox P系統介導的位點特異性重組技術[J].安徽農學通報,2009,15(15):27-28.

[12]Wang Y,Chen B J,Hu Y L,et al.Inducible excision of selectable marker gene from transgenic plants by the Cre/lox site-specific recombination system[J].Transgenic Research,2005,14:605-613.

[13]丁紅梅,邵根寶,徐銀學.內含子與基因表達調控[J].畜牧與獸醫,2006,38(3):50-52.

[14]徐芳,姚泉洪,熊愛生,等.重疊延伸PCR技術及其在基因工程上的應用[J].分子植物育種,2006,4(5):747-750.

[15]黃春曉,段學軍.以PCR為基礎的定點誘變方法研究進展[J].河南農業科學,2006(12):5-8.