青蒿琥酯對人卵巢癌細胞誘導血管新生的抑制效應

楊素梅 劉可玲 王立敏 高建宏 李華 高玉霞

卵巢癌患者病死率在女性生殖道腫瘤中居首位。高轉移率和復發率導致卵巢癌患者5年生存率長期徘徊在30%左右。腫瘤的侵襲與轉移依賴于腫瘤新生血管形成。血管新生(angiogenesis)是指在原有血管基礎上形成新的微小血管，是大多數惡性腫瘤生長和轉移的前提［1］。本實驗通過研究青蒿琥酯(artesunate，ART)對人卵巢癌CAOV3細胞促血管新生效應的影響及其機制，以進一步明確ART抗卵巢癌作用機制，探索卵巢癌治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 人卵巢癌CAOV3細胞由上海細胞生物研究所提供。ART購于桂林南藥股份有限公司(批號:090902;批準文號，國H:10930187)，使用前5%碳酸氫鈉注射液溶解。血管內皮生長因子(VEGF)、酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購于深圳晶美生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 人卵巢癌CAOV3細胞在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI-1640中37℃、5% CO2培養箱常規培養。取處于對數生長期的卵巢癌CAOV3細胞，分別給予不同濃度ART處理(ART處理組)。單純RPMI-1640培養基為陰性對照，無藥物作用的卵巢癌CAOV3細胞為陽性對照。

1.3 條件培養液收集 按照Kini等［2］的方法，首先將卵巢癌CAOV3細胞放入RPMI-1640不加或加入不同濃度的ART中培養48 h，然后用RPMI-1640將RPMI-8226細胞沖洗3次，并在無血清1640液中孵育4 h;收集細胞后用無血清1640液稀釋至1×106個/ml，繼續培養24 h。臺盼蘭排除試驗檢測卵巢癌CAOV3細胞的活力 ＞95%。無菌條件下 1 200 r/min和12 000 r/min分別離心10 min，制條件培養液，保存于-80℃。

1.4 主動脈環體外生長實驗 取大鼠胸主動脈，切成1 mm長的主動脈環。首先將1.2 mg纖維蛋白原和0.5 U牛凝血酶溶于無血清培養液MCDB-131，加于24孔板，待形成凝膠后，放入主動脈環，再加入纖維蛋白原和牛凝血酶，使成凝膠，以固定新生血管，加入培養液MCDB-131 1 ml，放入37°C、5%CO2培養箱里培養。在前 3 d，培養基中還需加入 ε-氨基己酸(300 μg/ml)以抑制纖維蛋白溶解。3 d后，加入已經準備好的條件培養液，與主動脈環一起孵育。另單獨加同容量RPMI-1640作為陰性對照。每天在倒置顯微鏡下觀察新生血管生長情況，直到第15天血管生成達到高峰。每組取6個主動脈環，計數新生血管數。

1.5 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內血管生長實驗 將孵化4 d的雞胚，在近氣室處開0.5 cm×1.0 cm窗，暴露接種部位(CAMs)。置孵箱內穩定24 h后，按如下方式分組處理:(1)陰性對照組:浸有RPMI-1640約1 mm3大小的可吸收明膠海綿，無菌置于雞胚CAM，作為陰性對照組。(2)單純CAOV3細胞組:在第6天，將浸有100 μl CAOV3細胞懸液(CAOV3細胞含量為5×106)的可吸收明膠海綿，無菌置于雞胚CAM。(3) ART處理組:將陰性對照組雞胚額外孵育1 d后，在第8天取出部分雞胚，給予不同濃度的ART。所有接種后的雞胚用消毒的半透明封口膜封口，窗垂直向上，送回孵箱中孵育。每天檢查CAM直到第12天，小心剝離各雞胚CAM，用固定液(甲醇、丙酮等比混合液)固定后拍照。

1.6 ELISA測定 終濃度為0、3、6和12 μmol/L ART處理CAOV3細胞48 h后，收集條件培養液。按照人VEGF ELISA檢測試劑盒說明書操作，測定條件培養液中VEGF含量。最小檢測限度為30 pg/L。所有實驗重復3次。

1.7 統計學分析 采用SPSS 10.0統計軟件計量資料以ˉx±s表示，采用Dunnett’st檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ART對大鼠主動脈環血管生成的影響 單純CAOV3細胞組第3天起鏡下可見有新生血管生成，第7～13天新生血管迅速增多，第14天后血管生成減慢并逐漸減少。ART預處理組新生血管形成以時間依賴方式減少，且形成時間明顯滯后，于第7～10天鏡下才觀察到有新生血管出現。同時ART處理組血管萌芽密度明顯降低。至第14天，陰性對照組新生血管數為(61.2±6.3);3、6和12 μmol/L ART預處理組新生血管數分別為(53.2±3.9)、(32.8±4.1)和(12.6±2.8)μmol/L，與單純CAOV3細胞組新生血管數(129.5±8.9)μmol/L比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 ART對CAOV3細胞誘導的CAM血管新生的影響 與陰性對照組比較，單純CAOV3細胞組表現出很強的刺激血管新生能力，眾多新生微血管呈放射狀排列于海綿周圍，血管密度、分支明顯增多，管徑增粗。而ART處理組刺激血管新生能力明顯減弱，血管密度、分支減少，管徑變細。3、6和12 μmol/L ART處理組與單純RPMI-8226細胞組比較，微血管數目分別減少21.9%，38.24%，76.9%(P＜0.01)。見圖1，表1。

圖1 ART對雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗中CAOV3細胞誘導血管新生的影響

表1 各ART處理組雞胚絨毛尿囊膜血管數

2.3 ART對CAOV3細胞條件培養液中VEGF含量的影響單純CAOV3細胞組中VEGF含量為(587±62)pg/ml。與單純CAOV3組相比，經3、6、12 μmol/L ART處理的RPMI-8226細胞條件培養液中VEGF含量以劑量依賴方式下降，分別為(462± 72)、(232±44)和(151±14)pg/ml，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤，易于轉移和復發是其致死的主要原因，腫瘤浸潤和轉移依賴大量腫瘤新生血管形成。研究發現:癌組織中存在顯著血管生成現象［3］;多項卵巢癌病例回顧性研究亦提示，卵巢癌組織微血管密度與臨床分期有關，是該疾病生存和復發的獨立預后因素［4］。在本研究血管生成實驗中，與對照組、藥物干預組相比，卵巢癌細胞組的主動脈環血管萌芽數和雞胚尿囊膜血管密度均顯著增加，進一步提示卵巢癌細胞具有極強促血管生成能力。

ARI是半合成的青蒿素衍生物，其高效低毒的抗瘧效應得到肯定，同時其對多種實體腫瘤細胞表現出的生長抑制作用也越來越引起國內外學者注意［5］。汪向紅等［6］用不同濃度ART處理體外培養的人卵巢癌CAOV3細胞，結果顯示ART可顯著抑制CAOV3細胞增殖。近年來有報道認為ART具有抗腫瘤血管新生的作用［7］。體外研究顯示ART可通過減少VEGF表達，抑制白血病K562細胞誘導的血管新生;體內實驗亦發現ART可強烈抑制Kaposi肉瘤鼠模型腫瘤組織內血管的發生發展［8］。但ART對人卵巢癌細胞誘導血管新生的影響作者尚未見報道。本研究選用3個較低濃度ART(3、6、12 μmol/L，胎盤藍拒染實驗證實細胞活力 ＞95%)［9］，觀察其對人卵巢癌CAOV3細胞誘導血管新生的影響。體外主動脈環培養實驗結果顯示:與單純CAOV3細胞組相比，ART處理組主動脈環上血管萌芽形成明顯推遲，密度顯著減少。提示ART對人卵巢癌CAOV3細胞條件培養液誘導的血管新生具有抑制作用。體內CAM血管生長實驗結果亦支持上述結論:與單純CAOV3細胞組相比，ART處理組血管分支明顯減少，密度顯著下降。進一步表明ART具有抗人卵巢癌CAOV3細胞誘導血管新生的能力。結合汪向紅等［6］發表的實驗數據，本研究認為ART具有抑制人卵巢癌細胞增殖分化、干擾卵巢癌血管新生的雙重作用。其抗血管新生作用機制一方面與ART直接抑制血管萌芽形成等血管新生過程有關，另一方面還可能與ART間接影響促血管新生調控因子表達有關［10］。

VEGF是血管形成過程中最強有力的調控因子，其與內皮細胞表面受體特異性結合，促進內皮細胞增殖、遷移，并最終形成新生血管。許多卵巢癌患者血漿VEGF水平明顯高于正常人，是判斷卵巢癌進展、轉移等臨床過程的重要標記物［10］。本研究發現，較低濃度ART即可抑制人卵巢癌CAOV3細胞分泌VEGF。VEGF表達減少一方面可能加強ART抑制腫瘤血管新生的效應;另一方面還可能減弱VEGF對卵巢癌細胞自分泌增殖促進作用［11］，抑制癌細胞增殖和轉移，發揮抗腫瘤效應。由此可見，ART很可能為卵巢癌臨床治療提供一條新途徑。

1 Bertolini F，Mancuso P，Shaked Y，et al.Molecular and cellular biomarkers for angiogenesis in clinical oncology.Drug Discov Today，2007，12: 806-812.

2 Kini AR，Peterson LA，Tallman MS，et al.Angiogenesis in acute promyelocytic leukemia:induction by vascular endothelial growth factor and inhibition by all-trans retinoic acid.Blood，2001，97:3919-3924.

3 王前，李新國，張怡，等.卵巢癌組織中EVEC的表達及其生物學意義.中華腫瘤雜志，2010，32:676-680.

4 Raspollini MR，Amunni G，Villanucci A，et al.Prognostic significance of microvessel density and vascular endothelial growth factor expression in advanced ovarian serous carcinoma.Int J Cynecol Cacer，2004，14:815-823.

5 He RR，Zhou HJ.Progress in research on the ant-tumor effect of artesunate.Chin J Inteqr Med，2008，14:312-316.

6 汪向紅，蔣依玲，范妮娜，等.青蒿琥酯對人卵巢癌細胞株增殖及p38通路的影響.中國醫院藥學雜志，2010，30:214-217.

7 Zhou HJ，Wang WQ，Wu GD，et al.Artesunate inhibits angiogenesis and downregulates vascular endothelial growth factor expression in chronic myeloid leukemia K562 cells.Vascul Pharmacol，2007，47:131-138.

8 Dell＇Eva R，Pfeffer U，Vene R，et al.Inhibition of angiogenesis in vivo and growth of Kaposi＇s sarcoma xenograft tumors by the anti-malarial artesu-nate.Biochem Pharmacol，2004，68:2359-2366.

9 Chen H，Shi L，Yang XY，et al.Overexpression of Ang-1 in multiple myeloma cells and supression of angiogenesis by artesunate through inhibtion of Ang-1 and VEGF expression.Int J Hematol，2010，92:587-597.

10 Chen HH，Zhou HJ，Wu GD，et al.Inhibitory effects of artesunate on angiogenesis and on expressions of vascular endothelial growth factor and VEGF receptor KDR/flk-1.Pharmacology，2004，71:1-9.

11 胡元晶，曲凡凡.VEGF及其受體在上皮性卵巢癌中的表達及與血管生成的關系.中國腫瘤臨床，2006，33:1346-1349.